目录

简要总结

摘要

1 引言

2 方法

3 结果

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简要总结

这篇文章主要研究了雄性小鼠在自发脑网络中记忆巩固的因果中枢定位。记忆巩固涉及学习后休息和睡眠期间全脑网络的自发重组，但具体机制尚不清楚。目前理论认为海马体在这一过程中至关重要，但其他脑区的作用仍不明确。本研究使用功能性磁共振成像（fMRI）技术，对雄性小鼠进行两种不同的空间记忆训练（主动位置回避任务，APA），并在训练后1天和8天进行静息态fMRI扫描，并观察大脑网络的变化。研究还通过化学遗传学方法（DREADDs）抑制特定脑区，以验证这些脑区对记忆巩固的影响。结果表明，两种空间记忆训练引发了不同的功能性连接，但感觉皮层和皮层下区域的网络对两种任务都是共同的。学习增强了全脑网络整合，前额叶、纹状体和丘脑区域在这一网络级重组中具有影响力。通过抑制学习后识别出的每个中心，导致了逆行性遗忘，证实了这些脑区的行为重要性。这些发现揭示了静息态网络中心在记忆巩固中的因果和功能作用，并表明除了海马体外，一个分布式的网络参与了这一过程。

摘要

学习后的记忆巩固涉及休息和睡眠期间自发的、全脑网络重组，但这是如何实现的仍然知之甚少。目前的理论表明，海马体是这种连接重塑的关键。在雄性小鼠中使用fMRI，我们发现一组不同的自发网络及其中枢有助于在学习后休息期间巩固记忆。我们发现，两种类型的空间记忆训练调用不同的功能连接，但感觉皮层和皮层下区域的网络对于这两种任务是共同的。此外，学习增加了全脑网络整合，前额叶、纹状体和丘脑区域对这种网络水平的重新配置有影响。学习后鉴定的每个中枢的化学遗传抑制导致逆行性健忘症，证实了行为意义。这些结果证明了静息状态网络中枢在记忆巩固中的因果和功能作用，并表明海马体以外的分布式网络服务于这一过程。

1 引言

持久记忆在大脑中的形成是一个分布的、动态的过程，但其机制尚不完全清楚。当前的系统记忆巩固理论表明，海马体介导来自学习过程中参与的分离的感觉、运动或动机大脑网络的信息编码，逐渐重塑它们的连接以形成长期记忆。这是通过学习相关神经元群体的重新激活（重放）和海马-新皮质网络在安静觉醒（静息状态）和睡眠的编码后时期的协调相互作用来促进的。这一过程是高度动态的，海马最初介导皮质可塑性，但之后新皮质网络变得更加活跃。除了海马体之外，其他区域在何处、何时以及如何参与促进这种系统范围的重新配置仍不清楚。任务执行过程中的全脑功能成像显示，在人类和啮齿动物中，在编码或回忆记忆时，不仅新皮质，而且皮质下区域都广泛参与。然而，在不明确的“离线”时期，如果不将它们与与重放相关的活动对齐，则很难确定参与巩固记忆的区域。

过去十年的一个重大进展是确定了在无任务条件下参与自发活动的全脑网络。功能连接（FC），测量为静息状态下区域活动之间的相关性，形成了功能相关区域的大规模网络，表明大脑的内在组织。这些静息状态网络（RSNs）的破坏与衰老和疾病中的认知障碍相关，为它们参与这些疾病的病因和进展提供证据。网络神经科学的进展进一步揭示了RSNs的拓扑随着性能或症状而变化，表明了它们的组织和动力学的行为相关性。重要的是，随着时间的推移，学习可以诱导人类和啮齿动物中RSNs的持续重塑。海马-新皮质FC与重复训练表现之间的关联增加，睡眠后的重新配置以及学习相关活动模式的重新激活表明编码后RSNs反映了系统记忆巩固。

然而，仍然存在的一个基本问题是，自发的网络变化是否会导致与其相关的行为或疾病相关状态。由于实验设计的观察性质、不受约束的成像环境和基于相关性的FC测量，观察到的RSN变化仍然有可能是由替代神经、生理或病理因素驱动的附带现象。此外，如果它们是因果关系，驱动这种大规模网络重塑的活动和领域仍未解决。分析方法可以从RSN推断因果关系。尽管如此，他们只估计网络内区域活动之间的相互依赖性，而不是行为的因果关系。至关重要的是，网络或其中枢是否是认知（如情景记忆）所必需的，使得其功能障碍导致残疾（如健忘症），而其促进提高表现，尚未通过前瞻性干预进行直接实验测试。

在这项研究中，我们通过识别和功能操作RSN中枢，揭示了在编码后休息期间有助于巩固记忆的大脑网络。我们研究了两个定义行为因果中心的假设，一个基于公共网络，另一个基于网络集成。海马-新皮质网络的某些元素，特别是海马结构（HPF，包括海马、下丘和内嗅皮层）、脾后皮层（RSC）和内侧前额叶皮层（mPFC）之间的元素，已经在不同的空间或情境学习范式中被识别。这些区域中各种形式的空间记忆轨迹（engram）的存储表明，系统整合中可能涉及一个公共的、任务不变的网络，尽管这个公共网络的全部范围仍然不清楚。此外，整合结合了来自功能隔离区域的新信息，使得这种整合可以在网络级别上表现出来。事实上，网络集成的拓扑特征，如全局效率，或隔离，如模块化，已经被证明与学习期间或之后的性能相关。在认知要求高的任务或隔夜巩固之后，也发现了网络整合的改变。这些发现表明，网络整合是学习和记忆的一个基本特征。因此，用于网络集成的有影响力的集线器（“集成商”集线器）可能在存储器形成中具有因果作用。

为了测试共同网络中枢（由不同学习范式一致调用的行为影响大脑区域）或整合中枢（行为影响大脑区域有助于网络整合）是否与记忆巩固有因果关系，我们在两种版本（早期和晚期检索）中训练小鼠主动地点回避（APA），一种空间记忆任务，并随后获得静息状态功能性磁共振成像（rsfMRI）数据，以表征学习后期间行为诱导的RSN变化（图1a）。先前的研究表明，不同的检索间隔可能通过不同的机制形成记忆，在短（1-5小时）检索间隔内网络活动和转录因子的升高有助于信息的整合，而在较长的间隔后涉及存储记忆的重新激活。这些过程中是否涉及相同的电路尚不清楚。此外，为了测试巩固期间的RSN是否依赖于海马向新皮质的转变，我们在学习后1天和1周进行了rsfMRI以跟踪网络重组的动态。我们还开发了从编码后RSN中检测公共或整合中枢的方法，我们的结果表明，感觉皮层通常在这两项任务后参与，前额叶皮层以及纹状体和丘脑核对于网络整合很重要。然后，我们通过在巩固期使用专门由设计药物激活的抑制性设计受体（DREADDs）单独沉默每个中枢，验证了已识别中枢的行为影响

图1 小鼠空间学习后RSN的变化。

2 方法

动物

实验中使用121只雄性C57BL/6小鼠(10-16周龄)。将动物饲养在透明笼中，并在20-22℃和40-60%湿度下维持12小时的明暗循环(上午7点亮灯，下午7点关灯)。食物和水随意提供。实验在光照阶段进行。所有实验程序均由昆士兰大学动物伦理委员会批准，并按照2001年昆士兰动物护理和保护法和澳大利亚出于科学目的护理和使用动物的行为准则进行。

实验设计

进行了两组动物实验，一组用于枢纽识别(图1)，另一组用于枢纽验证(图5)。四组小鼠用于中枢鉴定：1天APA(n=10)、1天对照(n=9)、5天APA(n=7)和5天对照(n=5)。十个组用于中枢验证：三个组用于公共网络，四个组用于网络整合，两个阴性对照（详见手术部分）和一个CNO对照（n=9）在未经手术的幼稚小鼠中。

我们使用DREADDs进行靶向抑制。手术后4周，对动物进行为期1天的APA任务训练。在他们完成最后一次训练试验（T5）后，立即通过腹膜内（i.p.）注射（1mg/kg溶解在盐水中）给予他们水溶性CNO（CNO二盐酸盐；目录号6329，Tocris Bioscience），然后在他们的饮用水中给予CNO（1mg/kg/天），以持续抑制网络中枢，直到探针测试前一天。这一天的间隔允许CNO从体内清除，从而最大限度地减少其对探针测试的干扰70。探针测试中的记忆保持用于检查记忆巩固是否受到中枢抑制的影响

行为训练

在APA任务中，一只动物站在一个旋转的圆形场地（直径：0.9 m；转速：1 rpm），墙壁两侧有四张图片作为空间线索（APA设备：生物信号组）。一旦动物进入相对于空间线索稳定的不可见扇区（电击区），就给予轻度电击（0.5 mA，60Hz，500ms）。动物需要学会使用视觉线索来识别厌恶区的确切位置并避开它。使用了两种训练方案：

i.在为期1天的APA中，动物接受了5次10分钟的训练，训练间隔约为1小时，在一天内完成。

ii.在5天APA中，动物每天接受一次10分钟的训练，连续5天。

训练从训练前一天的习惯化阶段（15分钟）开始，在此期间动物没有受到任何电击。在最后一个训练日9天后，进行10分钟探针测试以测量相同环境中的记忆保持力。在探针测试中，当动物进入厌恶区时，给予足部电击。在每次训练或探测会话期间，通过摄像机记录行为。包括两个对照组：1天假对照组和5天假对照组。在这些组中，动物经历了与实验组相同的APA程序，但没有接受任何足部电击。为了确保一致性，所有的行为实验都在一天的同一时间开始。对于数据分析，通过生物信号跟踪软件分析电击次数和首次进入电击区的时间。使用Prism(GraphPad Software LLC)进行重复测量单因素ANOVA。

MRI扫描

在9.4 T系统(BioSpec 94/30，Bruker BioSpin MRI GmbH)上进行MRI。对每只动物进行两次rsfMRI扫描，用于中心识别。最初使用3%异氟烷在2：1空气和氧气混合物中麻醉动物。在使用定制的牙棒和耳棒固定在MRI兼容支架中后，通过腹膜内递送美托咪定推注。导管（0.05-0.1 mg/kg）和异氟烷水平在10分钟内逐渐降低至0.25-0.5%，之后通过恒定的腹腔注射维持镇静。使用注射泵输注美托咪定（0.1 mg/kg/h）。关键生理参数，包括动脉血氧饱和度（SpO2）、直肠温度、心率和呼吸频率，由MRI兼容的监测系统（SAII公司）测量。用加热的水浴将体温维持在36.5℃。

高阶匀场后，首先进行结构T2加权MRI（分辨率=0.1 × 0.1 × 0.3 mm3）和视觉任务，以确保最佳生理学和神经血管耦合。5 Hz的闪烁蓝光由块状设计中的光纤递送，21秒开启和39秒关闭。然后使用多波段梯度回波回波平面成像108采集rsfMRI扫描，TR/TE=300/15 ms，4个切片带，矩阵尺寸=128 × 64（7/8部分傅立叶），厚度=0.5 mm，间隙=0.1 mm，16个轴向切片覆盖整个大脑，平面内分辨率为0.3 × 0.3 mm2。在10分钟内采集2000个体积，并以2分钟的运行间隔重复三次。为确保一致性，rsfMRI扫描在美托咪定推注后约45分钟开始。

DREADDs 的手术方法

在行为训练前至少一个月进行手术。手术期间用1.5-2%异氟烷麻醉动物。分别皮下注射恩诺沙星（6 mg/kg）和卡洛芬（5 mg/kg）以预防感染和缓解疼痛和炎症。用加热垫将体温维持在37℃。在手术期间，基于rsfMRI连接图和Paxions和Franklin小鼠脑图谱，第五版，将0.25-0.3 μ l病毒(AAV2/1-pSynhM4D(Gi)-T2A-mScarlet)注射到以下靶区域。坐标（相对于前囟）为：

常见枢纽：

(i) V1R (n = 10). ML: −2.30 mm; AP: −4.15 mm; DV: −0.50 mm.

(ii) S2R (n = 8). ML: −3.70 mm; AP: −0.71 mm; DV: −1.40 mm.

(iii) S1BFL (n = 11). ML: +2.88 mm; AP: −1.07 mm; DV: −0.85 mm. Integrator hubs:

(iv) LAcbShL (n = 7). ML: +1.70 mm; AP: +1.10 mm; DV: −3.85 mm.

(v) LOR (n = 8). ML: −1.65 mm; AP: +2.57 mm; DV: −1.9 mm.

(vi) VML (n = 10). ML: +0.75 mm; AP: −1.18 mm; DV: −4.05 mm

(vii) S1TrR (n = 7). ML: −1.63 mm; AP: −1.60 mm; DV: −0.57 mm.

阴性对照:

(i) VPMR (n = 5). ML: −1.5 mm; AP: −1.80 mm; DV: −3.3 mm.

(ix) FrAR (n = 5). ML: −1.70 mm; AP: +3.00 mm; DV: −0.50 mm.

使用Nanoject III(Drummond Scientific)在10分钟内以缓慢注射速率(0.03 μ L/min)注射病毒。将玻璃移液管再保持在适当位置6分钟，然后缓慢缩回。注射后，使用Vetbond(3M)闭合伤口并缝合。恩诺沙星和卡洛芬再给药两天。在APA测试之前，将动物饲养在其家笼中（每笼2-4只动物的分组饲养）4周以恢复并允许病毒表达。

行为与CNO治疗

同样的1天APA任务用于空间记忆训练。在1天的APA训练后，立即向动物施用水溶性CNO(1mg/kg，i.p.)以抑制靶脑区域的神经活性。然后提供含有CNO(1mg/kg/天)的水7天，以在记忆巩固期间保持靶脑区域受到抑制。在探针测试前24小时用正常水替换，以最小化CNO对行为表现的影响。在训练后第8天，进行10分钟探针试验以测试记忆保持。

组织学

向小鼠施用过量的戊巴比妥钠，并用40mL磷酸盐缓冲盐水(PBS)经心灌注，然后用45mL在PBS中的4%多聚甲醛进行固定。提取脑并在4℃下固定12-24小时。然后用PBS洗涤一次，并在切片前转移到30%蔗糖溶液中36小时。使用滑动切片机切割40 μ m厚的切片，并以1：6系列收集。细胞核用4'，6-二脒基2-苯基吲哚（DAPI，目录号6329；适马·奥尔德里奇）。首先将切片在PBS中洗涤一次10分钟，然后在1:50 0DAPIPBS溶液中在室温下孵育15分钟。两次洗涤后，使用荧光固定介质(Dako，Agilent)将切片固定在SuperFrost载玻片上。使用载玻片扫描仪(Metafer VSlide Scanner，MetaSystems)和显微镜(Axio Imager Z2，Zeiss)，具有20 × 0.8 NA/0.55mm物镜捕获图像。

rsfMRI数据处理

使用MATLAB（MathWorks Inc）、FSL（v5.0.11，https://fsl.fmrib.ox.ac.uk/FSL）、AFNI（版本17.2.05，美国国立卫生研究院）和ANTs（v2.3.1，http://stnava.github.io/ANTs）处理rsfMRI数据。首先在MATLAB中对多波段EPI的k空间数据进行相位校正和重建。通过FSL mcflirt进行运动校正后，通过FSL TOPUP对几何失真进行校正。使用PCNN3D110自动提取脑掩模，然后手动编辑。干扰信号，包括二次漂移、六个运动参数及其导数、来自脑外组织（包括肌肉和头皮）的十个主要成分，以及来自手动绘制的脑室面罩的脑脊液的平均信号，然后被回归出来111。数据在0.01-0.3 Hz下进行带通滤波，以解释镇静下的任何潜在频率偏移。该频率范围还可以去除高采样率数据中的混叠呼吸和心脏信号变化。使用ANTs通过线性和非线性变换将rsfMRI与EPI模板共同配准。然后通过0.6 mm高斯核平滑数据。

基于种子的相关性分析用于测量整个大脑的FC。基于澳大利亚小鼠大脑绘图联盟（AMBMC）图谱（https：//imaging.org.au/AMBMC/AMBMC），根据Paxions和Franklin小鼠大脑图谱中的分割，将大脑分为皮层、海马、丘脑和基底神经节中的190个双侧ROI 112。DSURQE图谱（https：//wiki.mouseimaging.ca/）用于标记AMBMC图谱（40个ROI）中尚未定义的区域，如杏仁核、下丘脑、中脑和脑干（脑桥）。组合的230个ROI用于以下基于种子的相关性分析。提取每个脑区的平均时间序列作为种子信号。使用AFNI 3dNetCorr计算种子时间过程之间的Pearson相关系数。Fisher z变换用于将相关系数转换为z值。计算每只动物的三次重复扫描的连接性矩阵。基于视觉任务激活的存在进行质量控制（QC）。如果视觉激活不可检测，则认为生理状况和神经血管耦合是次优的，并且丢弃扫描。根据这一标准，24%的扫描被丢弃（补充表S4）。由于动物的生理状况可以在扫描会话之间变化，它可以在训练后第1天显示视觉反应，但在训练后第8天不显示视觉反应，反之亦然，其结果是数据集在两个时间点不是一对一匹配的。对通过QC的每个时间点的每只动物的基质进行平均。

通过双样本t检验计算组间差异，并使用基于网络的统计工具箱(https://sites.google.com/site/bctnet/comparison/nbs)将阈值定为p<0.05(FDR校正)。为了检测常见的网络集线器，网络和行为相关性均以p<0.05为阈值，未校正（详见下文“1天和5天APA之间的行为相关常见网络”小节）。为了识别积分器中枢，使用三个未校正阈值p<0.05、p<0.01和p<0.005来生成用于CI分析的未加权（t分数）网络矩阵。使用BrainNet Viewer（https：//www.nitrc.org/projects/bnv/）将重要连接覆盖在3D渲染的脑图谱上。

分组独立成分分析与双重回归

使用FSL MELODI（https：//fsl.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fslwiki/MELODIC）对1天APA和1天对照的预处理rsfMRI数据集进行组ICA。在分离成30个组分后，进行双重回归(http://fsl.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fslwiki/DualRegression)以确定组间差异。使用FSL-glm进行双样本t检验，并通过AFNI 3DClusterSim估计聚类水平校正（p<0.05，双尾，总体家族错误率p<0.05）。基于小鼠113的其他rsfMRI研究，将ICA成分分为信号和伪影。训练后第1天的21个成分和训练后第8天的18个成分被鉴定为信号。组水平空间ICA图的阈值为Z≥1.96（相当于p<0.05，未校正），用于可视化。

图论分析

HITS分数是一种链路分析算法，用于向网络分配权限和集线器索引。节点的权限指示有多少高质量节点链接到它，而节点的集线器索引指示该节点有多少链路连接到高质量节点。在这里，我们使用Matlab实现（https://people.sc.fsu.edu/~jburkardt/m_src/hits/hits.html）来基于其中枢索引对编码后RSN中枢进行排名，因为权威显示了类似的排名（数据未显示）。

巨连通分量的定义是网络中最大的连接分量。它可以用最大连通分量中的节点数来表示。CI 分析中巨型分量的比率用于表示从网络中移除节点时巨型分量的变化。

为了评估大脑网络的小世界特性，计算了归一化特征路径长度lambda、归一化聚类系数 gamma 和小世界指数 sigma。首先在预定范围内（0.01 < z < 0.07，步长 0.01，z = 0.0254 对应 p = 0.05，z = 0.07 对应 p < 0.00001）对单个 FC 矩阵进行阈值化。选择的最大阈值是所有 FC 矩阵完全连接（无孤立节点）的值。利用 Matlab 代码（https:// github.com/mdhumphries/SmallWorldNess）从阈值化网络中计算 Sigma、gamma 和 lambda。为了计算 sigma，我们使用 Erdos Renyl 随机图，通过输入阈值网络的总节点数（230）和平均阶数来估计随机网络的路径长度和聚类系数。在上述范围内绘制趋势图后，计算 AUC，并进行双样本 t 检验，以检验 APA 组和对照组之间的差异。

FC-行为相关性

我们使用Pearson相关系数将每个显著FC的强度与探针测试中的两个行为指标（电击次数和首次进入电击区的时间）相关联，p<0.05（双尾）被视为显著。在相关分析之后，我们根据相关系数的绝对值对显著连接进行排序。

1天和5天APA之间的行为相关常见网络

我们将行为相关的共同网络定义为在两个任务中都显示的连接，其连接强度与记忆保持相关。这就要求一个连接满足两个网络阈值和一个行为阈值，这两个阈值加在一起相当于一个更严格的阈值，可以同时降低真阳性率和假阳性率。因此，我们降低了节点阈值，以便在控制假阳性率的同时获得适当的功率。我们从1 天和 5 天 APA 任务的网络矩阵中检测到了 APA 组和对照组之间的重叠连接。我们从重叠的连接中计算出 FC 行为相关性，并根据行为相关性的绝对值对重要的连接进行排序（p < 0.05，未校正）。将这些未经校正的阈值组合在一起，根据置换检验估计的无效分布，得出了 p < 0.05 的全系误差率。

网络属性的零分布分析

为了确定APA组和对照组之间的差异矩阵与随机网络是否有显著差异，文章使用大脑连接性工具箱的 “null_model_und_sign ”函数创建了5000个随机网络，该函数保留了真实网络的度和强度分布。在 t = 2 到 3.8（步长为 0.2）的阈值范围内，为每一个 5000 个随机网络生成了三个网络属性的曲线，包括巨大分量、全局效率和模块性。计算每条曲线的 AUC，形成每种网络属性的空分布。

常见网络分析的零分布

为了估计共同网络的无效分布，将每个FC 矩阵随机分配到 APA 组和对照组中，创建了 5000 个 FC 矩阵的排列。通过两样本 t 检验来测试这些排列矩阵的组间差异，在未校正的情况下，以 p < 0.05 为阈值。1 天 APA 和 5 天 APA 数据包被的共同 FC 与探针测试的 Nshock 或 Tenter 相关，阈值为 p <0.05。从 5000 次排列中幸存于这些阈值的连接数构成了共同网络检测的无效分布。

3 结果

相似的行为导致不同的编码后RSN

结果表明，HPF、mPFC和RSC通常参与空间或上下文记忆的巩固。为了研究相似的空间学习是否在编码后休息中调用共同的网络，我们进行了两个APA任务，训练试验相同，但试验间隔不同：一小时（1天APA，因为学习在一天内完成）与一天（5天APA；图1a）。APA允许在压力小于与水迷宫相关的压力的小鼠中评估空间导航和记忆，方法是根据重复试验中的空间线索训练它们避开电击区（图1b）。学习后，在训练后第1天和第8天进行两次rsfMRI检查，以检查RSNs的可塑性。在第二次rsfMRI扫描后一天，进行探针测试以评估记忆保持。使用动物接受的电击次数（Nshock）和首次进入电击区（拉幅机）的时间来测量它们的行为表现。在学习过程中Nshock逐渐减小，Tenter增加；这与探针测试期间获得的相似值一起（图1b；补充结果），证明小鼠在9天后可以同样好地记住两个APA任务，并形成持久记忆。

我们通过比较大脑模板中230个高度分割的大脑区域之间的FC来区分编码后RSN（图1c；补充表S1）的APA组与其自己的对照。在对照组中，动物暴露于APA训练程序，而没有任何足部电击，因为我们发现随机电击引发了强烈的应激反应。尽管两种APA测试在学习和检索过程中的行为相似，但我们发现了不同的编码后RSN。在训练后第1天（图1d；双样本t检验，p<0.05，错误发现率【FDR】校正），1天APA增加了内嗅皮层和脑桥核之间左半球的稀疏FC，脑桥核是小脑和大脑皮层之间运动信号的关键中继和变压器；以及背侧前扣带皮层（【A24a】，mPFC的一部分）和嗅觉结节之间，嗅觉结节参与感觉引导的奖励/动机行为但降低了右半球体感皮层和前额叶皮层之间以及HPF和脑桥之间的FC。相反，5天APA增加的FC主要在右半球，包括HPF、前额叶皮层和感觉区域。这种高度偏侧化的FC（17个连接中的12个）与报道右半球在记忆处理中占优势的研究一致。APA培训一周后，网络进行了重组。在1天APA组中，发现了更多的半球间FC，在体感皮层、外侧伏隔壳（LAcbSh，参与进食、奖励和动机行为的区域）和腹侧内嗅皮层中观察到FC增加，而外侧眼眶皮层（LO，参与决策和海马依赖性记忆获得的前额叶区域）、体感皮层、丘脑和脑桥之间的FC降低。5天APA组仅发现右半球HPF、前额叶皮质和丘脑之间稀疏的FC。也可以使用独立成分分析(ICA)来鉴定可比的编码后可塑性，揭示感觉皮层中的分布式网络，关于与编码后FC的关系知之甚少。为了测试编码后FC是否与记忆保持相关，我们在探针试验中计算了FC强度与Nshock或Tenter之间的Pearson相关性（图1e）。在1天APA组中，训练后第8天只有两个连接与行为相关：左后外侧皮质杏仁核（PLCo）和LAcbSh之间（r=0.87，p=0.0045）以及右初级体感皮质颌骨区域和下丘之间（r=0.82，p=0.012）。尽管在5天的APA中有几种连接增强，但未发现与行为的相关性。这表明最显著的FC可能对行为没有影响。

定位与行为相关的常见网络中心节点

我们预测，两种APA任务通常诱导的行为相关RSNs对记忆巩固有影响。由于组合两个FDR校正的阈值降低了真阳性率，我们首先将双样本t检验的阈值降低到未校正的p<0.05，以发现由两个任务诱导的常见RSN（图2a）。尽管它们的任务设计相似，但在两个APA任务中仅发现了一小部分FC，3.56%（训练后第1天）和2.85%（训练后第8天）的连接重叠。为了确定因果中枢，我们在探针测试中选择了与行为表现相关的FC。使用排列测试，将两个未校正的网络阈值和与Nshock的行为相关性（阈值为p<0.05）一起施加在训练后第1天和第8天的公共连接上，导致p<0.05的等效家族误差（图2b，c）。当使用拉幅机作为行为指标时，常见连接的家族假阳性率在训练后第1天为p=0.019，但在训练后第8天不显著（补充图S2）。在这里，我们选择使用Nshock作为主要行为指标。

我们在训练后第1天发现了由左半球海马、mPFC和丘脑组成的行为相关共同网络，以及右半球初级体感和初级视觉（V1）皮层之间的连接（图2b，补充表S2）。排除已知参与记忆巩固的HPF和mPFC以及皮质下区域，左侧初级体感皮层桶区（S1BFL）的FC具有最高的行为相关性（CA3-ORL-S1BFL，r=0.68，Cohen的d=0.93），其次是右V1（V1R-S1R，r=0.57，Cohen的d=0.89；图2d和补充图S3）。在训练后第8天（图2c，补充表S2），带有mPFC的FC消失了。相反，我们观察到网状核（Rt）和RSC的FC，网状核驱动对睡眠期间记忆巩固很重要的神经振荡。mPFC在第1天的参与和一周后的沉默与该区域印记的时间动态一致8。排除内嗅和脾后皮质，右侧次级体感皮质（S2R）具有最高的行为相关性（CA3-ORL-S2R，r=0.80，Cohen’s d=1.26；图2e和补充图S3）。总的来说，我们发现HPF，mPFC和RSC之外的扩展的行为相关公共网络在学习后的不同时间参与。在这里，我们选择了效应大小较大的S1BFL、V1R和S2R作为验证的目标。

图2 行为相关公共网络的识别。

学习改变网络整合

基于网络整合在学习和记忆中的重要性，我们预测后编码RSNs在空间学习后会更加整合。为了研究这一点，我们应用了图论分析，将大脑网络简化为节点（大脑区域）和边（FC强度）。为了评估网络集成和分离，我们使用了几种图论指标：全局效率、模块化、传递性、巨连通分量的大小和小世界拓扑属性。全局效率衡量反映集成的最短路径长度。模块化计算网络组件和组件内连接的大小和数量，是隔离的度量。传递性度量集群内节点紧密连接的程度，因此反映了隔离。巨连通分量的大小是代表网络集成的最大互连节点集群。小世界拓扑是大脑网络的一个关键特征，表现出局部分离和长程整合。我们使用归一化特征路径长度λ评估小世界特征；归一化聚类系数，γ；还有小世界属性，σ。

随着t分数阈值从2.0增加到3.8（未校正），双样本t检验后的连接矩阵变得更加分散，导致巨大分量、全局效率和传递性减少，但模块化增加（图3和补充图S4）。为了测试总体差异，我们计算了曲线下面积（AUC），并将其与5000个随机网络的分布进行了比较。基于零分布，除了训练后第8天的5天APA之外，两种APA训练方案都显著增加了巨大成分的大小（图3a和补充图S4a）。总体效率仅在训练后第8天的1天APA中增加（图3b和补充图S4b）。有趣的是，除了训练后第8天的5天APA外，模块化显著增加（图3c和补充图S4c）。1天而不是5天的APA学习导致传递性显著降低，表明编码后网络是分布式的，而不是紧密连接的（图3d和补充图S4d）。除了训练后第8天的5天APA之外，使用未加权网络也可以观察到类似的趋势（补充图S5和补充图S6）。小世界特征是在单个RSN上计算的，因为双样本t检验矩阵太稀疏。我们发现，与对照组相比，学习后小世界适马有增加的趋势，这是由于更高的局部分离（增加的γ）和长程整合（减少的λ）的趋势（补充图S7）。有趣的是，在5天APA中，训练后第1天的小世界性显著降低（补充图S7c），这是由于显著更长的路径长度和较低的聚类，表明稀疏分离。

在最近的一项研究中也发现了这种矛盾增加的网络整合和分离，该研究报告了自动执行认知要求高的任务的重复训练，可以增加编码后RSNs46的整合和分离。为了理解这些特征的原因，我们检查了模块化度量背后的关键元素：组件的数量和组件内的连接。我们发现组件内连接的比例稳步增加，但随着阈值的增加，组件数量趋于平稳（补充图S8）。这表明，比组件之间的连接强得多的组件内连接导致了模块化的增加。总之，这些结果表明，APA学习通过形成松散链接的、更大和更多的网络组件来增加网络集成和隔离，同时也加强了组件内的连通性。

图3 编码后RSN的图论特征。

表1 CI分析确定的网络集成十大节点

区分整合中心的最佳方法  

由于网络整合是编码后RSN 的一个特征，确定整合中心将使我们能够检验其在记忆巩固中是否是因果必需的。我们预测，当移除（抑制）一个整合中心时，网络整合会受到极大阻碍，导致巨连通分量的崩溃。用于中心识别的最佳方法应是能以移除最少节点的方式大幅减小巨连通分量大小的方法。中心性通常被认为反映了网络整合，它描述了网络通信和整合的重要性。然而，模拟表明中心性是因果推断的一个糟糕衡量标准。为了确定中心识别的方法，我们比较了四种中心性度量（度中心性、接近中心性、中间中心性、特征向量中心性）、链接权威 HITS（超链接诱导主题搜索）得分以及集体影响力（CI），后者在最优渗流模型中寻找能够迅速瓦解大型网络的节点。我们通过逐一移除排名/中心性较高的节点，计算了编码后 RSN 中巨组件的缩减情况。图 4b 展示了一个示例，其中通过移除由 CI 检测到的节点，归一化巨组件大小迅速下降，随后移除由度中心性和介数中心性识别的节点，而接近中心性、HITS 和特征向量中心性的影响则较慢。在训练后第 1 天和第 8 天来自两个 APA 组的网络中也观察到了类似的趋势（补充图 S9）。比较巨组件变化的 AUC，CI 分析导致巨组件最快崩溃（图 4c，补充图 S10）。这表明 CI 是识别整合器枢纽的更好方法。

与行为相关的整合器枢纽的识别

我们对编码后的RSN 应用 CI 分析，以识别其功能连接与记忆保持相关联的节点（图 4a）。如图 1d 所示，使用 FDR 校正阈值会使网络变得非常稀疏，没有巨组件，从而排除了使用 CI 分析进行枢纽识别的可能性 67，69。在此，我们使用了多个未经校正的阈值（p < 0.05、0.01 和 0.005），以确定在 1 天 APA 训练后打破 RSNs 时节点的平均排名。在训练后第 1 天，排名前 10 的节点大多位于皮质下区域，包括基底神经节、中脑和脑干中的区域，而海马旁回（下托和内嗅皮层）和 S2 区域的排名则较低（表 1）。在训练后第 8 天，与皮质下区域相比，更多的皮质区域（顶叶联合区、感觉区和前额叶皮质）排名靠前。与通过 HITS 得分确定的枢纽相比，有 8 个枢纽与通过 CI 分析发现的枢纽相同，尽管排名不同（补充表 S3）。为了确定对行为有影响的候选节点，我们选择了在探针测试中节点功能连接与记忆保持相关联的 CI 节点（表 2）。我们发现，在训练后第1天，右尾壳核与Nshock的相关性最高（CA1-LMOLR-CPUR，r=0.79，p=0.0063，Cohen的d=1.25），左LAchSh与Tenter的相关性最高（LACBSHL-RTR，r=0.95，p=3.7 × 105，Cohen的d=1.21）。在训练后第8天，具有高行为相关性的结节FC包括左侧丘脑腹内侧核(VML-A30L，r=0.91，p=0.0015，Cohen’s d=-1.37）、左侧初级体感皮层前肢区(S1FLL-MEAR，r=0.89，p=0.0033，Cohen’s d=1.36）、右侧LO(VLL-LOR，r=0.87，p=0.0045，Cohen’s d=1.25）、右侧导水管周围灰质(EAL-PAGR，r=0.84，p=0.0088，Cohen的d=1.43）和右侧初级体感皮层躯干区（PODGR S1TRR，r=0.84，p=0.0095，Cohen的d=1.35；补充图S3）。这些节点中的一些具有高CI排名（前3），而一些具有低排名（后3）。基于平均CI排名，我们选择LAchShL、LOR、VML和S1TrR作为高、中、低排名中心进行验证。

图4 网络枢纽的选择

表2 包含前10个CI节点的行为相关功能连接

通过DREADDs抑制验证因果中枢

为了验证所选中枢在记忆巩固中的因果作用，我们注射AAV2/1-pSyn-hM4D(Gi)-T2A-mScarlet以在每个区域的所有神经元中单独转染抑制性DREADDs(图5a)。手术后一个月，动物接受为期1天的APA训练。在完成五个训练试验后，立即通过腹膜内注射给动物施用氯氮平N-氧化物（CNO），然后饮用含有CNO的水，以维持对靶向中枢的抑制7天，直到探针测试前一天，以允许CNO 70，71的清除。除了对照CNO作用的幼稚组外，我们还选择了一个皮质区域，即右侧额叶关联皮质（FrAR）和一个皮质下区域，即右侧腹侧后内侧丘脑（VPMR），其在我们的分析中未出现，作为阴性对照。图5b，e，g示出了实验组和对照组中靶向区域中良好的病毒表达，尽管我们确实注意到在附近的脑区域中存在一些病毒表达，例如S2R和LacBsh1。动物成功地学习了为期1天的APA任务(图5)。两个阴性对照组的五次训练试验的一致改善表明，基于第一次和最后一次试验的比较，手术本身不影响空间学习（VPMR的t=6.06，p=0.0038；FrAR的t=8.55，p=0.0010；图5c）。在接受CNO一周后，与它们自己的最后一次训练试验（T5）相比，阴性对照（FrAR和VPMR）或CNO对照组（图5d）中的小鼠在探针测试中显示出完整的记忆回忆（对于VPMR，t=2.28，p=0.085；对于FrAR，t=1.63，p=0.18；对于CNO对照，t=1.76，p=0.12）。相反，在抑制每个常见中枢S1BFL(t=4.23，p=0.0017）、V1R(t=3.76，p=0.0045）和S2R(t=3.57，p=0.0091）后，Nshock显著增加，在巩固期，高或中排名积分器中枢LAcbShL（t=3.85，p=0.0084）、LOR（t=3.63，p=0.0084）和VML（t=2.49，p=0.034）（图5f，h）。抑制低等级节点S1TrR后未发现差异（t=1.14，p=0.30）。与CNO对照相比，当抑制S1BFL(Cohen's d=0.76，p=0.046)、V1R(Cohen's d=0.78，p=0.045)、S2R(Cohen's d=0.94，p=0.025)、LAcbShL(Cohen's d=1.04，p=0.017)或LOR(Cohen's d=1.10，p=0.0090)，但不抑制VML(Cohen's d=0.0040，p=0.20)或S1TrR(Cohen's d=-0.045，p=0.47)时，发现T5和探针测试之间的Δ Nshock显著更大(图5i)。除V1R外，拉幅机在这些区域也表现出类似的趋势（补充图S11）。这些结果表明，抑制普通中枢或中到高级整合中枢会损害记忆巩固。

图5 中枢抑制的恐惧表达和行为效应。

4讨论

定义大脑区域及其在学习后发生的自发的全脑重组中的功能参与对于理解记忆巩固的电路和机制至关重要。尽管RSNs中存在的自发网络活动已经被确定了几十年，并被认为在学习和记忆中发挥作用，但这种功能尚未被直接证明。在这里，我们证明了除了HPF和mPFC之外，感觉区域通常参与APA学习，并且前额叶、纹状体和丘脑区域对于网络整合至关重要。我们证实，在成功学习后抑制这些RSN中枢会损害记忆的形成。我们的结果证明了编码后RSN和记忆巩固之间的因果联系，并揭示了分布式网络介导了这一过程，并为推断行为的因果中心提供了有效的方法。这扩展了我们对参与记忆形成的全脑网络的理解。考虑到人类和啮齿动物RSNs的可比组织和特性，我们经过验证的方法有可能确定干预目标，以调节认知和行为。

使用中心性、丰富俱乐部和命中等度量来构建拓扑。然而，高中心性节点可能不一定是最有影响力的节点。特别是，尚不清楚大脑网络中枢是否以及如何对行为产生因果影响。在这项研究中，我们结合行为和拓扑特征来识别两种对行为有影响的后编码RSN集线器：公共网络和积分器。我们发现，行为定义的公共网络集线器（在APA任务中显示，并具有与记忆保持相关的连接）和拓扑（巨型组件的崩溃）以及行为定义的积分器集线器可以因果地影响行为。从拓扑的角度来看，集成商集线器将类似于链接两个网络模块的连接器节点。然而，连接器节点可能不一定对行为有影响。我们还发现CI分析可以在测试的网络措施中有效地检测集成商集线器。识别有影响力的节点仍然是网络科学中的一个挑战。其他方法，如k-shell分解、积分值影响和VIP，将有助于选择候选节点以测试其行为效应。

HPF和mPFC是记忆研究中最常见的目标。除了这些领域，我们还验证了通常支持系统整合的扩展网络的参与情况。我们发现丘脑和基底神经节中的几个皮质下区域被两种APA任务调用，这与最近一项关于情境恐惧条件反射的研究中报告的高度分布的皮质下印记一致。尽管只发现了一些新皮质连接，但它们的中枢是记忆巩固所必需的。我们发现感觉区域（V1、S1BF和S2）参与系统巩固。据报道，早期视觉皮层在巩固视觉工作记忆中起作用；然而，它参与长期记忆巩固尚未得到证实。

虽然海马体不直接驱动初级感觉区域，但在V1中观察到慢波睡眠期间迷宫运行活动模式的回放，支持其参与。已经发现S1参与运动记忆巩固，但不参与空间记忆巩固。最近，在S1中发现了类似于海马体中位置细胞的空间选择性活动，为位置-身体协调提供了一种机制。我们的结果提供了证据表明S2参与记忆巩固，可能是由于它在整合足部电击中涉及的体感信息中的作用。我们的分析表明，S2在功能上与海马CA3区相连，需要进一步研究其与HPF在空间记忆形成中的相互作用。

我们的结果证明了整合器中枢在记忆形成中的重要作用，并支持了网络整合是记忆过程中关键因素的观点。这与一项啮齿动物研究一致，该研究表明，从协变量c-fos活性网络估计的大脑区域的抑制导致与行为障碍相关的巨大成分的减少。我们还表明，在识别集成商枢纽方面，CI比中心性更有效，这是枢纽重要性的另一种衡量标准，命中得分仅检测到LO，但遗漏了其他集成商枢纽（补充表S3）。特别是，我们发现了分级行为效应，高阶积分器中枢（LAcbSh和LO）具有较大的效应大小，而中阶中枢（VM）具有中等的效应大小，低阶中枢（S1Tr）具有最小的效应。这表明我们的分析可以预测行为效应。在测试的整合器中枢中，LAcbSh的识别与其参与学习和记忆是一致的和空间信息的整合。它也是在两个APA任务中都活跃的中枢（图2b，c）。LO是决策和获得海马依赖性记忆的关键前额叶区域，但它在记忆巩固中的作用知之甚少。VM是运动丘脑的一部分，是感觉（包括伤害性）和运动信息的汇聚部位，并投射到新皮层，特别是mPFC。它参与决策，但它在学习和记忆中的作用仍不清楚。

海马-新皮层网络中学习期间时空活动的编码后重放已被证明是记忆维持和巩固的重要机制。在新皮层中，在动物和人类学习过程中参与的感觉（如视觉和听觉）或运动皮层中观察到了回放。基于与学习过程中fMRI激活的相关性，在人类编码后休息期间也发现了海马回放。然而，FC变化，如这里观察到的编码后RSNs，是否反映了海马新皮质的回放尚不清楚。据报道，促进重放的高频振荡，称为涟漪，在学习后耦合海马体和联想皮层，表明编码后FC的存在。结合功能磁共振成像和电生理学，一项对麻醉猴子的研究表明，海马波纹与默认模式网络的激活相一致。最近通过光学成像在小鼠中发现了类似的结果，通过脑磁图在人类中发现了类似的结果。这些发现表明，编码后RSN可能反映或协调重放。

睡眠在支持记忆巩固方面起着几个重要作用。在慢波睡眠期间，重放清醒时编码的信息，增强新皮层、海马体和丘脑之间的串扰是最活跃的。睡眠还恢复突触稳态，如突触强度重整和树突棘向下选择，这为大脑第二天的经历做准备。在睡眠期间或之后也使用fMRI观察到相关活动。睡眠可以加强海马前额叶的功能连接，稳定学习诱导的网络。皮质和皮质下区域，特别是纹状体之间的编码后RSN在睡眠期间和之后增强，这与我们的发现一致，即涉及更广泛的网络。重放也可以通过在睡眠期间呈现先前相关的线索来诱导，导致海马-皮质FC增强，特别是网络整合增加。总之，这些发现表明睡眠在促进大脑网络重组以巩固记忆中的重要作用。由于两种APA学习的编码后RSN都是在睡眠后测量的，它们可能反映了睡眠的影响。与1天APA相比，5天APA中涉及的多天睡眠可能导致不同的编码后RSN。

系统整合可能持续数周、数月甚至数年，但网络会随着时间的推移而相互转换和交互时间尚不清楚。非侵入性rsfMRI允许在动物模型和人类中进行纵向成像，以补充侵入性成像，如c-fos成像，它在记忆编码或回忆期间捕捉快照。我们在两个时间点观察到的rsn及其中枢的变化支持了这种持续的可塑性。在公共中枢中，主要感觉区域在训练后第1天被识别，而S2在训练后第8天被识别。这表明在这个过程的后期，从早期记忆巩固期间的主要区域过渡到联想区域。另一方面，积分器中枢从HPF和皮质下区域传输训练后第1天至训练后第8天的新皮质区域。这与HPF在系统整合中的参与逐渐减少是一致的。

在后编码时段期间识别的集线器可以参与形成、存储或调用记忆。我们只在学习后抑制中枢，直到探针测试的前一天。这使我们能够在不影响记忆回忆的情况下确定他们参与了记忆巩固。这些集线器是否也是内存存储的区域将需要进一步研究。例如，最近一项使用活动标记技术的研究报告称，腹外侧眼眶皮层，而不是感觉皮层，可以存储情境恐惧印记。未来的研究可以结合类似的技术来确定RSN集线器在记忆存储中的具体作用。

在这项研究中，我们使用了一种镇静方案进行rsfMRI，该方案在检测RSNs和编码后可塑性方面是可靠的，之前的一项研究表明它不影响记忆巩固。尽管如此，某些网络的检测，如参与厌恶性学习范式的杏仁核，可能会受到影响。超快fMRI允许提高大脑腹侧部分的灵敏度，并且能够用杏仁核（例如PLCo）检测FC（图1）。清醒成像的进一步发展应该有助于更全面地绘制和测试功能网络，不仅在编码后，而且在学习或回忆期间。由于基于图谱的种子感兴趣区域（ROI）的体积变化，较小区域的灵敏度将由于较少的信号平均而较差。本研究中高度采样的rsfMRI数据（6000个时间点）部分补偿了这一敏感性问题。使用区域优化的种子ROI或冷冻探针将进一步提高未来研究中的灵敏度。

精读分享

主要内容

这篇文章主要研究了雄性小鼠在自发脑网络中记忆巩固的因果中枢定位问题，探讨了大脑是如何在学习后的休息和睡眠期间进行全脑网络的自发重组以实现记忆巩固的，并试图确定哪些脑区和网络在这一过程中起关键作用。

研究目的

旨在揭示学习后自发脑网络中的因果中心对记忆巩固的影响，并确定哪些脑区是记忆巩固过程中的关键中枢，以深入理解大脑网络在记忆形成中的作用机制。

研究数据

实验中使用121只雄性C57BL/6小鼠(10-16周龄)。将动物饲养在透明笼中，并在20-22℃和40-60%湿度下维持12小时的明暗循环(上午7点亮灯，下午7点关灯)。

研究方法

使用功能性磁共振成像（fMRI）技术，对雄性小鼠进行两种不同的空间记忆训练（主动位置回避任务，APA），并在训练后1天和8天进行静息态fMRI扫描，以观察大脑网络的变化。

运用图论分析等方法来评估大脑网络的整合和分离特性，包括全局效率、模块化、传递性、巨大连通分量的大小以及小世界特性等指标。

使用化学遗传学方法（DREADDs）抑制特定脑区，以验证这些脑区对记忆巩固的影响。

研究结果

两种空间记忆训练引发了不同的功能性连接，但感觉皮层和皮层下区域的网络对两种任务都是共同的。学习增强了全脑网络整合，前额叶、纹状体和丘脑区域对这种网络级重组具有重要影响。通过抑制学习后识别出的每个中心，导致了逆行性遗忘，证实了这些脑区的行为重要性。研究还发现，学习后的大脑网络变化具有因果性，并且可以通过特定的网络分析方法来识别这些因果枢纽。

研究结论

研究表明，除了海马体和内侧前额叶皮质外，感觉皮层在APA学习后也普遍参与其中，并且对于网络整合而言，前额叶皮层以及纹状体和丘脑核是关键区域。通过抑制这些RSN中心可以损害记忆形成，从而证实了自发放电网络与记忆巩固之间的因果联系，并揭示了一个分布式网络介导了这一过程。这些发现不仅扩展了人们对大脑中记忆形成网络的理解，还提供了有效的推断行为因果中心的方法，为未来的认知和行为干预研究提供了可能的靶点。

参考文献：

Li, Z., et al., Locating causal hubs of memory consolidation in spontaneous brain network in male mice. Nat Commun, 2023. 14(1): p. 5399.