学习目标
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了解设置重复对于 RNA-seq分析的重要性 -
了解生物重复次数、测序深度和鉴定到的差异表达基因之间的关系 -
了解如何设计 RNA-seq实验，以避免批次效应
1. 注意事项
了解 RNA 提取和 RNA-seq 文库制备实验过程中的步骤，有助于设计 RNA-seq 实验，但有一些特殊的注意事项需要明确：
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重复次数和类型 -
避免混淆 -
处理批次效应
2. 重复
实验重复可以通过技术重复或生物学重复来实现，如下图：
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技术重复
使用相同的生物样本重复实验步骤，以准确测量技术差异并在分析过程中将其去除。
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生物学重复
使用相同条件下的不同生物样本来衡量样本间的差异。
在微阵列时代，技术重复被认为是必要的；然而，当前的 RNA-seq 技术，技术差异远低于生物差异，因此不需要技术重复。相反，生物重复对于差异表达分析是绝对必要的。
对于差异表达分析，生物学重复越多，对生物学变异的估计就越好，我们对平均表达水平的估计也就越精确。因此，数据可以进行更准确的建模并识别更多差异表达的基因。
如上图所示，生物重复比测序深度更重要，测序深度是每个样本测序的读数总数。该图显示了测序深度和重复次数对鉴定出的差异表达基因数的关系。与增加测序深度相比，重复次数的增加往往会得到更多的差异表达基因。因此，通常更多的重复比更高的测序深度更好，但需要注意的是，检测低表达的差异表达基因和执行异构体水平（可变剪切）的差异表达分析需要更高的深度。
下面列出了一些关于重复和测序深度的建议，用于实验规划：
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通用建议：
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ENCODE 建议每个样本有 3000 万个 SE reads。 -
如果有大量的重复 (>3)，每个样本 1500 万次 reads通常就足够了。 -
如果可能，进行更多的生物重复。 -
通常建议读取长度 >= 50 bp
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含有低表达基因：
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同样，重复比测序深度更有作用。 -
深度更深，至少有 30-60 百万 reads，具体取决于表达水平。
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异构体水平的差异表达：
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新亚型的深度应该更大（每个样本 > 6000 万 reads）。 -
对 RNA质量进行质控。
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其他类型的
RNA分析（内含子保留、small RNA-Seq等）：-
取绝于具体的分析
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★总之，尽量做生物学重复。
”
3. Confound
Confounding 是指：无法区分结果是由什么原因导致的。
例如，我们知道性别对基因表达有很大影响，如果我们所有的对照组小鼠都是雌性而所有处理组小鼠都是雄性，那么我们的治疗效果就会被性别混淆。我们无法区分是处理的作用和性别的作用。
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如何避免：
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如果可能，确保每种情况下的动物都是相同的性别、年龄和批次。 -
如果不可能，则确保在不同条件下平均分配动物。
4. 批次效应
批次效应是 RNA-seq 分析的一个重要问题，仅由批次效应就能导致显著的表达差异。
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如何确定是否有批次效应
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是否所有的 RNA提取都是在同一天进行的？ -
是否所有的文库构建都是在同一天进行的？ -
是否同一个人对所有样品进行了 RNA提取与文库制备？ -
是否对所有样品使用了相同的试剂？ -
是否在同一地点进行 RNA提取与文库制备？
如果任何一个答案是“否”，那么就存在批次效应。
5. 建议
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如果可能，以避免分批的方式设计实验。 -
如果无法避免分批：
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不要按批次混淆实验：
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跨批次拆分不同样本组的重复。重复次数越多越好（超过 2 个）。
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请务必在实验数据中包含批次信息。在分析过程中，如果没有混淆，可以回归出由于批次引起的变异，所以有这些信息，它不会影响结果。
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