杂交水稻可大幅增产但制种效率受限于不育系的低异交率。柱头外露率是决定异交率的关键性状然而其遗传调控机制特别是独立于粒形调控的直接通路尚不明确。近期四川大学水稻研究所团队在国际知名期刊Nature Communications发表题为“Mutation in HER1 enhances stigma exsertion and hybrid seed production in rice”的研究论文。该研究鉴定一个水稻柱头高外露突变体her1揭示了HER1基因通过表观遗传机制负调控下游基因DS2的表达从而直接控制柱头大小的分子通路并利用该功能缺失等位基因成功培育出高异交率不育系使田间杂交制种产量提升。爱基百客为该研究提供CUTTag、RNA-seq和重测序的技术支持。研究结果01her1突变体表现出柱头增大及柱头外露率增加研究通过EMS诱变在籼型三系杂交稻保持系II-32B中筛选获得一个高柱头外露率突变体her1。与野生型相比her1的柱头外露率由36.32%提高至70.63%增幅达94.47%。形态学分析表明her1的雌蕊整体增大表现为柱头长度、柱头宽度和花柱长度均显著增加说明其高柱头外露表型与雌蕊增大密切相关。农艺性状调查显示her1仅表现出轻微的粒长、粒宽和千粒重下降以及一定程度的结实率降低而单株穗数、穗长和每穗粒数未发生显著变化同时其花粉育性正常说明结实率下降并非由花粉败育造成。扫描电镜观察进一步揭示her1柱头刷毛的密度和厚度均明显增加整体呈现更为健壮的形态此外her1花柱表皮细胞表现为长度减小、宽度增加提示其柱头总长度的增加主要来源于花柱纵向细胞数目增加而非细胞伸长。总体来看her1是一个具有较高育种利用潜力的高柱头外露率突变体。图1her1突变体表现出柱头增大及外伸率增加。02 HER1编码一种含SET结构域的蛋白质遗传分析表明her1突变体的高柱头外露表型由单个隐性核基因控制。通过全基因组重测序和MutMap分析研究将目标基因定位于2号染色体上的 LOC_Os02g47900HER1。在her1中HER1第4外显子发生A-to-T突变导致编码精氨酸的密码子转变为终止密码子进而造成蛋白提前终止翻译并导致SET结构域截短及post-SET结构域完全缺失。HER1编码含SET结构域蛋白SDG706推测该突变为功能缺失型突变。功能验证结果进一步证实HER1敲除材料在II-32B背景中重现了her1的柱头增大和高外露率表型而在her1背景中导入HER1功能互补载体后相关表型恢复至野生型水平说明HER1是控制her1表型的目标基因。与此同时在ZH11背景中敲除HER1同样导致柱头增大和外露率显著升高表明HER1对该性状的调控具有广泛适用性。相比之下HER1过表达并未引起明显表型变化提示HER1主要作为柱头大小和外露率的负调控因子发挥作用其功能缺失而非表达增强是导致表型变异的关键。图2HER1编码一种SET结构域蛋白。03 HER1特异性结合甲基化组蛋白H3K9并调控H3K9me2水平HER1编码一个含SET结构域的核定位蛋白其系统发育位置提示其与拟南芥SUVR5等H3K9甲基化相关蛋白具有较近亲缘关系。体内实验表明HER1突变显著影响柱头中的H3K9me2水平说明HER1参与H3K9me2相关表观遗传调控。然而与典型SET结构域蛋白不同HER1在多种体外酶活检测体系中均未表现出可检测的H3K9甲基转移酶活性提示其可能并非传统意义上的HKMT“writer”。进一步的结合实验显示HER1能够特异识别H3K9me1/2/3而不结合其他赖氨酸位点的甲基化肽段或未修饰H3肽段其中对H3K9me2的亲和力最高。结构域分析表明这一识别功能依赖于包含pre-SET、SET和post-SET结构域的P3区域而her1突变所编码的截短蛋白则完全丧失该结合能力。由此推测尽管HER1可能缺乏HKMT活性但其更可能通过识别P3结构域特异性结合并维持H3K9甲基化状态。图3HER1蛋白特异性结合甲基化组蛋白H3K9并调控H3K9me2水平。04 HER1通过调控下游DS2的转录来调节柱头形态基于HER1对体内组蛋白甲基化的影响研究进行CUTTag与RNA-seq联合分析结果表明HER1是一个与H3K9me2密切相关的转录抑制调控因子。HER1缺失后柱头中全局H3K9me2水平显著下降并伴随着大批基因表达上调说明HER1主要通过维持H3K9me2抑制性修饰来限制下游基因转录。HER1在全基因组范围内主要富集于启动子、基因间区及基因体区域且其结合峰H3K9me2富集峰显著重叠进一步支持了HER1参与H3K9me2存在密切关联。在筛选出的候选靶基因中柱头特异表达基因DS2被鉴定为HER1的重要直接下游靶标。HER1在DS2启动子和基因体区显著富集同时H3K9me2水平显著降低而在her1突变体中HER1在DS2的富集显著减少。值得注意的是WGBS结果显示DS2位点DNA甲基化水平始终较低且在野生型与her1之间无明显差异表明HER1对DS2的调控独立于DNA甲基化途径。遗传功能分析进一步表明DS2过表达可促进柱头增大和柱头外露而DS2缺失则抑制柱头发育并削弱her1的大柱头表型。这些结果进一步说明HER1通过调节H3K9me2水平来调控DS2的表达最终控制柱头的大小与外露。图4通过CUTTag与RNA测序技术揭示了HER1的下游靶标。图5HER1与DS2之间的遗传关系。05 her1等位基因增强杂交种子产量对533份水稻种质资源的分析表明HER1在自然群体中仅存在有限的变异6个主要的单倍型其单倍型与柱头长度及DS2表达之间未显示明确的关联且HER1位点的核苷酸多样性明显低于侧翼区域提示HER1基因座的最小自然变异可能是自然选择而非人工选择的结果。将her1功能缺失等位基因导入不育系II-32A后新材料herA表现出显著增大的柱头和更高的柱头外露率并在初步异交试验和大田制种试验中均表现出稳定提高的异交率和制种产量。更重要的是基于herA配制的杂交组合在主要农艺性状和产量方面与对照组合无显著差异说明her1的潜在负效应在杂交一代中能够被显性HER1等位基因有效掩盖。总体而言HER1是一个具有明确实践应用价值的杂交稻制种改良基因资源。图6HER1功能缺失等位基因增强了不育系II-32A的异交习性和杂种种子产量。综上研究报道了一个HER1基因其通过直接控制柱头大小来调节柱头外露其作用机制与那些调节籽粒形状的基因不同。HER1编码一个包含SET结构域的蛋白特异性结合发生甲基化的组蛋白H3第9位赖氨酸并调节H3K9me2水平。HER1的功能缺失会导致H3K9me2水平降低从而增加下游靶标DS2的转录并使柱头变大。利用HER1的功能缺失等位基因研究培育出了一个高外露率雄性不育系herA在田间条件下该品系可将杂交制种产量提高20%以上这充分证实了HER1在提高杂交制种产量方面的育种价值。研究中利用CUTTag和RNA-seq的联合分析确定了HER1的下游靶基因目前春季大促做CUTTag送RNA-seq有相关需求的老师欢迎咨询~