https://www.frontiersin.org/journals/immunology/articles/10.3389/fimmu.2023.1145300/full

目标：肿瘤微环境(TME)在子宫内膜癌(EC)的进展中起着重要作用。我们旨在评估EC的TME中的细胞群体。

方法：我们从GEO下载了EC的单细胞RNA测序(scRNA-seq)和空间转录组(ST)数据集，并从TCGA下载了TCGA-UCEC项目的RNA-Seq (FPKM)和临床数据。使用R软件对这些数据集进行了分析。

结果：我们获得了5个scRNA-seq数据集，1个ST数据集和569个RNA测序样本。在来自scRNA-seq的33,162个细胞中，共检测到20亿个转录本和33,408个基因。这些细胞被分类为9个簇，EC细胞来源于上皮细胞和纤毛细胞。基因集变异分析(GSVA)表明，上皮细胞和内皮细胞亚簇中富集的通路显著不同，表明EC具有很大的异质性。细胞间通讯分析显示，EC细胞发出的信号最强，内皮细胞接收到的信号多于其他细胞。进一步分析发现，上皮细胞的1号和2号亚簇表现出更具恶性的表型，可能通过MDL-NCL信号通过MK通路将恶性表型传递给内皮细胞的0号亚簇。

我们还使用ST数据分析了空间邻居之间的通讯，并证实了MDL-NCL在细胞间通讯中的发现。TCGA和GEO分析表明，NCL的表达水平与ImmuneScore呈负相关。

结论：我们的研究揭示了EC细胞可以通过MDK-NCL信号将恶性表型传递给内皮细胞，并且NCL与免疫活性的抑制有关。EC细胞可能通过抑制免疫细胞和通过MDK-NCL信号“教育”基质细胞来塑造TME。

结果

1.scRNA-seq和EC的细胞分型

所有进行单细胞RNA测序（scRNA-seq）的5个组织样本均来自患有子宫内膜样癌的患者。在经过质量过滤后，在33,162个细胞中总共检测到20亿个UMIs（Unique Molecular Identifiers，独特分子标识符）和33,408个基因。我们发现有几个簇仅由一个样本组成，这表明可能存在批次效应（图1A），因此我们使用CCA（Canonical Correlation Analysis，典范相关分析）来校正批次效应。这些细胞被分类为9个簇，其标记基因显示在补充表S3中。根据这些标记基因，这9个簇被分配到已知的细胞谱系，包括成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞、T细胞、NK细胞、巨噬细胞、纤毛细胞、肥大细胞和B细胞（图1A）。图1B显示了每种细胞类型的代表性标记基因的表达水平。我们发现，根据MUC16/CA125的表达，EC细胞来源于上皮细胞和纤毛细胞，并且癌细胞检测到的转录本数量多于其他细胞（图1A、C，补充表S4）。

图1 子宫内膜样癌33,162个单细胞的概览。(A) 这里分析的33,162个细胞的统一流形近似与投影（UMAP），每个细胞根据（从左到右）：原始数据和整合数据中相应的患者、相关的细胞类型以及在该细胞中检测到的转录本（UMIs）数量（以插图中定义的对数尺度）进行颜色编码。K，代表千。(B) 各细胞类型的代表性标记基因的表达情况。© 对于9个细胞簇（从左到右）：来自5个患者的细胞比例、细胞数量以及转录本数量的箱线图。

2.内皮细胞的亚簇

总共检测到3,736个内皮细胞，并重新聚类为3个簇（图2A）。基于它们的标记基因（补充表S5），簇0和1被指定为血液内皮细胞，簇2被指定为淋巴内皮细胞（图2B）。进一步分析显示，与血管生成相关的选定基因在簇0和1中高度表达（图2C）。通路分析显示三个簇之间存在显著的表型多样性，簇0涉及的通路多于其他两个簇（图2D）。我们分析了TCGA（The Cancer Genome Atlas，癌症基因组图谱）中标记基因的表达，并发现簇0的标记基因在SCC（鳞状细胞癌）和EAC（子宫内膜样腺癌）中的表达水平高于EM（浆液性子宫内膜癌），然而，簇1和2的标记基因显示出相反的趋势（图2E）。使用标记基因进行的生存分析显示，HSPA1B、TFF3和LAMA4与EC生存相关（图2F）。

图2 内皮细胞簇。(A) 3,736个内皮细胞的统一流形近似与投影（UMAP）图，根据它们对应的患者（左侧）或相关的簇（右侧）进行颜色编码。(B) UMAP图根据血液和淋巴内皮细胞的标记基因表达（蓝色到灰色）进行颜色编码。© 参与血管生成的选定基因的小提琴图。(D) 不同簇之间通过GSVA（基因集变异分析）按每个细胞评分的通路活性差异。图中显示的是线性模型的t值。(E) 在TCGA样本中，来自子宫内膜（EM，n = 35）、浆液性囊腺癌（SCC，n = 133）或子宫内膜样腺癌（EAC，n = 401）的每个簇的内皮细胞标记基因的平均表达水平。(F) 在TCGA中，与子宫内膜癌患者总体生存率相关的三个标记基因。

3.上皮细胞亚簇

总共检测到5,586个上皮细胞并重新聚类为5个簇（图3A）。这些簇的标记基因列在补充表S6中，代表性标记基因显示在图3B中。为了描述这些簇的功能，我们比较了通路活性。簇0与其他四个簇有很大不同。簇1和2以及簇3和4相似（图3C）。TCGA中标记基因的平均表达水平显示在图3D中。除了簇4之外，所有簇的标记基因在EAC（子宫内膜样腺癌）和EM（浆液性子宫内膜癌）之间或SCC（鳞状细胞癌）和EM之间显示出显著的关联。使用标记基因进行的生存分析显示在图3E中，有六个基因与EC（子宫内膜癌）生存相关（图3E）。

图3 上皮细胞簇。(A) 5,586个上皮细胞的统一流形近似与投影（UMAP）图，根据它们对应的患者（左侧）或相关的簇（右侧）进行颜色编码。(B) 每个簇的代表性标记基因的表达情况。© 不同簇之间通过GSVA（基因集变异分析）按每个细胞评分的通路活性差异。图中显示的是线性模型的t值。(D) 在TCGA样本中，来自子宫内膜（EM，n = 35）、浆液性囊腺癌（SCC，n = 133）或子宫内膜样腺癌（EAC，n = 401）的每个簇的上皮细胞标记基因的平均表达水平。(E) 森林图显示了TCGA中标记基因的风险比（HR，95%置信区间）。

4.单细胞RNA测序数据中细胞间的通讯

我们使用CellChat分析了9个细胞簇之间的通讯，使用单细胞RNA测序数据。这些细胞通过27条通路相互交流（图4A，B）。图4A，B中的通路按其强度排序（从左到右），最上面的通路是MK通路。上皮细胞发出的信号最强（图4A，C，D，S1）；内皮细胞接收到的信号多于其他细胞（图4B，D）。我们发现细胞主要通过MK信号通路中的MDK-NCL配体-受体（L-R）对进行接触（图4E，S2）。MK信号通路中的信号显示在图4F中，MK通路中的配体和受体的表达水平显示在图4G中。中胚素（MK，MDK）主要在上皮细胞和纤毛细胞中表达，而核仁素（NCL）在所有9种类型的细胞中表达。

图4 细胞间通讯。(A) 点图显示了分泌细胞发出信号模式的比较。(B) 点图显示了接收信号模式的比较。© 圆形图显示了相互作用细胞间的通讯强度。(D) 细胞发出和接收的互动强度。(E) 比较细胞间显著的配体-受体对，这些对有助于成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞、巨噬细胞和纤毛细胞向T细胞、NK细胞、肥大细胞和B细胞发出信号。(F) 和弦图显示了MK信号的推断细胞间通讯网络。(G) 小提琴图显示了参与MK信号网络的8个基因的表达情况。

5.上皮细胞和内皮细胞之间的相互作用

我们进一步分析了上皮细胞亚簇和内皮细胞之间的通讯。我们发现上皮细胞的簇1（Ep.1）发出的信号最强，内皮细胞的簇0（En.0）接收到的信号多于其他簇（图S3A-C）。MK也是涉及上皮细胞和内皮细胞之间通讯的首要通路。MDK-NCL仍然是首要的L-R对（图S3D）。

6.生态位相互作用

我们还使用ST（空间转录组）数据和NICHES（邻域细胞间通讯估算系统）分析了空间邻居之间的通讯。总共在1,351个点检测到660万个UMIs（Unique Molecular Identifiers，独特分子标识符）和33,538个基因。在一个点中，大约检测到4,911个UMIs和2,403个独特基因。我们分析并整合了ST数据与scRNA-seq（单细胞RNA测序）数据集，并且在scRNA-seq中检测到的7种细胞类型被映射到EC（子宫内膜癌）组织切片上（图5A，B）。我们使用空间散点饼图来展示这7种细胞类型的分布和比例（图5A），上皮细胞是主要的细胞类型。然后我们使用NICHES研究细胞生态位，NICHES估计了ST数据中的局部微环境。从图5C的UMAP（Uniform Manifold Approximation and Projection，均匀流形近似与投影）图中我们可以看到，8个簇的微环境之间存在一些显著的重叠，这些重叠暗示了它们之间存在相互作用。我们计算了“NeighborhoodToCell”检测中所有L-R（配体-受体）对的行和，然后按降序排列这些和。图S4列出了前20个L-R对。我们发现MDK（中胚素）出现在前20个L-R对中的5个，包括MDK-NCL（中胚素-核仁素）。我们进一步将MDK、NCL以及MDK-NCL的生态位相互作用绘制到组织区域（图5D）。

7.由MDK–NCL通路诱导的免疫抑制环境

为了探索MK通路在子宫内膜癌（EC）中的作用，我们使用TCGA（癌症基因组图谱）的数据分析了该通路中配体和受体的表达水平。所有配体和受体在SCC（鳞状细胞癌）和EM（浆液性子宫内膜癌）之间或EAC（子宫内膜样腺癌）和EM之间都有差异表达（图6A）。MDK在SCC和EAC中的表达水平高于EM。NCL在SCC和EM之间的表达仅有轻微差异。在我们的队列中，MDK和NCL在EC组织中的表达水平都高于正常组织（图6B）。

我们使用estimate软件包计算了TCGA队列的ImmuneScore（免疫评分）、StromalScore（基质评分）和ESTIMATEScore（估计评分），并评估了它们与MK通路中基因的关系。显著的关联显示在图6C中。我们注意到大多数基因与评分呈负相关（图6C），并且NCL与所有三个评分都呈负相关（图6D）。在分析了GSE120490数据集后，我们进一步确认了TCGA数据集中的发现（图S5），因此EC细胞可能通过MDK-NCL信号传导在肿瘤微环境（TME）中通过MK通路抑制免疫细胞反应。