文献

Single-cell transcriptomic analysis uncovers the origin and intratumoral heterogeneity of parotid pleomorphic adenoma
单细胞转录组学分析揭示了腮腺多形性腺瘤的起源和瘤内异质性
IF:10.8中科院分区:1区 医学WOS分区:Q1

摘要

多形性腺瘤 （PA） 是唾液腺中最常见的良性肿瘤，具有很高的形态复杂性。然而，PA 的起源和瘤内异质性在很大程度上是未知的。在这里，我们构建了单细胞分辨率的 PA 综合图谱，并显示 PA 表现出五个肿瘤亚群，三个概括了正常腮腺的上皮状态，以及两个肿瘤特有的 PA 特异性上皮细胞 （PASE） 群。然后，鉴定出 6 个 PASE 细胞亚群，它们在上皮、骨骼、免疫、代谢、干性和细胞周期特征方面存在差异。此外，我们揭示了 CD36 + 肌上皮细胞是 PA 中的肿瘤起始细胞 （TIC），并以 PI3K-AKT 通路为主。靶向 PI3K-AKT 通路显着抑制 CD36 + 肌上皮细胞衍生的肿瘤球和 PA 类器官的生长。我们的结果为 PA 的多样性和起源提供了新的见解，为在 PA 治疗中靶向 PI3K-AKT 信号通路提供了重要的临床意义。

结果

PA 和腮腺的单细胞图谱

为了探索 PA 的细胞景观，我们使用 1 个正常腮腺 （PG） 和 3 个 PA 样本生成了单细胞 RNA-seq 图谱（图 D）。如图 1 所示。S1a、H&E 染色显示 PA 的病理结构在不同样本中有所不同，反映了多形性结构特征。在去除低质量细胞并进行基因表达归一化后，共处理 35662 个单细胞进行进一步分析，并根据基于图的聚类和使用 UMAP 进行降维观察到 8 个细胞簇（图 D）。S1b、c）。如图 1 所示。S1d、e、UMAP 显示不同 PA 样品中的细胞分布相似，但与 PG 相比，PA 中的细胞分布差异显著。这一发现表明，尽管形态结构不同，但 PA 可能具有统一的细胞景观。然后，根据经典基因标记的表达和使用 SingleR 包进行评估对 7 种主要细胞类型进行注释（图 D）。1b–d，图S2 和补充表 1），包括表达 KRT8、KRT14、KRT5、EPCAM、KRT18 和 AQP5 的上皮细胞;表达 PECAM1 、 ENG 和 CDH5 的内皮细胞;表达 COL3A1 和 DCN 的成纤维细胞;表达 CD3D 、 CD3E 、 CD8A 、 NKG7 和 GNLY 的 NK/T 细胞;表达 CD79A 和 CD79B 的 B 细胞;表达 MZB1 的浆细胞;以及表达 CD68 、 CD74 、 CLEC9A 和 CD163 的髓系细胞。值得注意的是，我们观察到 7 个簇中的每一个都包含来自不同样品的细胞，尽管细胞类型比例不同，这表明主要细胞类型在 PA 和 PG 中基本一致（图 D）。1e）。

PA 和 PG 上皮细胞的分子特征

如图 1 所示。2a，UMAP 显示 PG 和 PA 的上皮细胞分布存在显着差异。为了表征 PG 和 PA 上皮细胞，我们根据染色体间隔的平滑表达谱推断每个样品上皮细胞中的拷贝数变异 （CNV）。我们发现 PA 上皮细胞的 CNV 水平明显高于 PG 上皮细胞（图 D）。推断的 CNV 数据分析显示 1、9、19、22 号染色体上有显著的拷贝数扩增，但观察到 4、16、18 和 20 号染色体上有显著的缺失（图 D）。值得注意的是，在 12 号染色体上观察到了戏剧性的变化。在以前的研究和其他几种腺源性肿瘤（如乳腺癌和胰腺导管腺癌）中也观察到类似的基因组改变，表明腺源性肿瘤可能具有一些常见的基因组改变。随后，鉴定出一组标记基因在 PA 和 PG 上皮细胞中上调。正如预期的那样，在 PG 上皮细胞中观察到与唾液腺和唾液酶分泌相关的标记基因的高表达，如 PRB1、CLDN3、PRB3、SMR3B、HTN1 和 PIGR17,18，而已证实促进 PA 发育的几种癌基因在 PA 细胞中增加，包括 PLAG1、WIF1、S100B、CDK4、LIFR 和 NFIB（图 D）。2d、e 和图S3a-c）。基于差异表达基因 （DEGs） 进行基因本体论 （GO） 富集分析，发现细胞外基质组织和骨骼系统发育等基质形成相关通路参与肿瘤上皮，提示 PA 上皮发生异常基质形成（图 D）。相比之下，与唾液腺生理功能相关的几种途径主要富集在 PG 上皮中，包括唾液分泌和检测参与苦味感官感知的化学刺激

PA 特异性上皮细胞亚群

将 PG 上皮细胞重新聚集后，在 PG 中鉴定出 3 种主要细胞类型，包括表达 AQP5 的腺泡细胞、表达 KRT18、WFDC2、KRT8 和 KRT7 的导管细胞以及表达 KRT14 和 ACTA2 的基底细胞/肌上皮细胞，它们与唾液腺内已知的功能细胞一致。 同样，PA 细胞的重聚集产生了 5 种主要细胞类型，其中 3 种在 PG 中也观察到，包括腺泡细胞 （AQP5）、导管细胞 （KRT18、KRT8、KRT7、WFDC2） 和基底细胞/肌上皮细胞 （KRT14、ACTA2），表明 PA 肿瘤细胞大致概括了 PG 细胞亚群，在正常 PG 和 PA 中具有几个共同的标记基因（图 D）。有趣的是，发现了两个独特的 PA 特异性上皮细胞簇，它们被命名为 PA 特异性上皮细胞 （PASE） 亚群，并表现出高表达o f MUCL1 （PASE1） 和 COMP （PASE2） （图 .引人注目的是，PASE 亚群占 PA 肿瘤细胞的 86.5%。

为了进一步研究 PASE 细胞的异质性和分子特征，我们以更高的分辨率对 19360 个 PASE 细胞进行了分析，产生了 6 个具有不同转录谱 （C0-C5） 的突出细胞亚群，反映了 PASE 细胞的异质性（图 D）。有人认为上皮-间充质转化 （EMT） 代表了 PA 中组织异质性的基本原理。重要的是，EMT 被认为负责在许多肿瘤中产生肿瘤起始细胞。然后，我们首先在这六个 PASE 细胞群中检测 EMT 状态，发现 C0、C1、C2、C4 和 C5 细胞都表现出较高的 EMT 评分 （n = 200 个基因，P < 2.2 × 10-16）（图 D.值得注意的是，C4 细胞的 EMT 评分最高，但 C3 细胞的 EMT 评分最低。这些结果表明 C4 细胞是未分化细胞，C3 细胞高度分化，C0 、 C1 、 C2 和 C5 细胞表现出过渡或中间状态。此外，除 C3 细胞外，所有 PASE 亚群都表达高水平的 EMT 相关基因，例如 COL1A1、COL1A2、COMP、MMP2 和 EMP3（图 D）。有趣的是，EMT 的几种主转录因子在 C0、C1、C2 和 C4 细胞中也有所增加，包括 SOX4、SIX1、ZEB1 和 TWIST1 （图 1）。这些结果表明，EMT 广泛发生并在 PA 发展中起关键作用，这可能有助于 TIC 的产生和基质样成分的形成，例如粘液样和软骨样成分。

然后，根据众所周知的标记基因和功能富集分析对 PASE 亚群的转录状态进行注释。如图 1 所示。4a、b 和补充表 2，我们观察到 C0 细胞表达腺泡细胞标志物（AQP5、AQP1）和基底细胞标志物（KRT5、KRT14），具有上皮发育和液体分泌的特性，表明 C0 细胞表现出杂交状态。C1 细胞显示 SFRP2 和 CTGF 的高表达，据报道它们可增强成骨分化。元功能富集显示 C1 细胞与细胞外基质组织、骨发育和软骨发育相关，表明 C1 细胞是软骨样成分。C2 细胞表达 IGLC2 并表现出免疫和炎症特征，这意味着这些细胞可能触发免疫反应和炎症反应。基于上述特征，由于 EMT 评分高和基质细胞的特性，我们将 C0 、 C1 和 C2 细胞定义为间充质样细胞。此外，C3 细胞表达 MUCL1 和经典导管细胞标志物 KRT7、KRT18 和 KRT19（图 D）。功能富集显示 C3 细胞以代谢重编程为特征。C5 细胞表达高水平的增殖相关基因（如 MKI67 和 TOP2A），并且具有最高的细胞周期评分，这也与细胞周期基因特征相关（图 D）。4d， e）。值得注意的是，我们观察到 C4 细胞表现出高水平的肌上皮细胞标志物 （ACTA2）、肌生成相关基因 （CASQ2、IGFBP7、MYL9）、血管生成相关基因 （SPARCL1、ITGA7、CALD1）和干性相关基因 （CD36、THY1、ITGA7）。功能富集显示 C4 细胞与血管发育和肌肉结构发育相关，表明 C4 细胞可能具有多分化潜力。然而，C4 细胞缺乏经典的干性相关转录因子的表达，包括 SOX2、BMI1、GLI1、NANOG 和 OCT4（图 D）。因此，我们进行了单细胞调节网络推理和聚类 （SCENIC），其中将 MAFB、LEF1 和 TBX2 指定为可能控制 C4 细胞的主 TF（图 D）。4g），已被证实与干性和 EMT 有关。这些发现表明 C4 亚群是一种独特的肌上皮细胞群，在 PA 中具有肿瘤起始潜力。总的来说，我们分别将 C0-C5 细胞定义为杂交细胞、软骨细胞、免疫调节细胞、MUCL1 + 导管细胞、祖细胞和循环 PASE 细胞（图 D）。

PA 中的肿瘤起始细胞

在组织学上，PA 的特征是具有“上皮”和“基质”区域的双相结构。47 目前，几项研究表明，上皮细胞和基质元件是单克隆的，来源于相同的前体细胞。5,6然而，目前尚不清楚哪种细胞负责肿瘤发生并产生 PA 中的上皮和基质成分。如上所述，我们表明 C4 PASE 细胞在 PA 中可能具有肿瘤起始潜力。为了进一步研究 PA 细胞的起源和发育轨迹，我们使用 PASE 细胞的前 100 个 DEGs 进行了轨迹分析。这种无监督方法确定了细胞状态的连续体，并显示了两种不同的轨迹，从状态 2（分支前）开始，逐渐分支到状态 1 和状态 3，对应于两个不同的细胞命运（细胞命运 1 和细胞命运 2），揭示了具有不同命运的共同起源（图 D）。5a、b）。在伪时间轨迹中，我们研究了 6 种 PASE 亚型的分布模式。如图 1 所示。5c 和图 .S4a、C4 细胞主要在伪时间位置最低的状态 2 结束时观察到，而 C3 细胞主要出现在伪时间位置最高的状态 1 结束时，支持我们之前的观点，即 C4 细胞是 PA 的祖细胞，而 C3 细胞是高度分化的导管细胞。C0 、 C1 、 C2 和 C5 细胞沿轨迹分散，反映了它们的过渡或中间状态。值得注意的是，C4 的高表达基因标记 （ACTA2 、 IGFBP7 、 THY1） 位于低伪时间位置，进一步表明 C4 细胞是 PA 中的祖细胞。代表分化的上皮细胞（KRT19、EPCAM、KRT18）和间充质样细胞（CNMD、COMP、SOX9）的标志物也位于适当的伪时间位置（图 D）。S4b-d）。此外，C4 细胞通过参考已报道并包含在 GSEA48-50 中的基因集，表现出干性相关基因特征和肿瘤发生相关基因特征的高表达（图 4）。5d-f）。综上所述，这些结果表明 C4 细胞是 PA 中的肿瘤起始细胞。
为了研究沿轨迹的整体表达动力学的潜在变化，我们按伪时间对基因表达进行排序并进行富集分析，以研究细胞命运改变的确切影响。我们发现有 6 种基因表达模式 （P1-P6） 解释了差异（图 D）。5g，补充表 3）。经历 cell-fate1 的细胞表达高度稳态的相关分子，富含唾液腺功能，包括唾液分泌和单羧酸代谢过程 （P1， P3）。经历 cell-fate2 的细胞表达高水平的富含骨骼系统发育、细胞外基质组织、炎症反应和免疫系统细胞因子信号传导的基因 （P2， P6），这与上述间充质样细胞的特征一致（图 .5g，图S5）。这些功能富集反映了 PA 在两条发育途径中的细胞成分，支持 PA 的 TICs 可以发育成高度分化的上皮细胞形成导管结构和具有过渡状态的间充质样细胞形成基质的观点，包括粘液样、软骨状或粘液软骨状。