文章标题：Metabolite asymmetric dimethylarginine (ADMA) functions as a destabilization enhancer of SOX9 mediated by DDAH1 in osteoarthriti

发表期刊：Science Advances

影响因子：14.95

作者单位：浙江大学医学院附属邵逸夫医院

百趣提供服务：iTRAQ/TMT标记定量蛋白质组

研究背景

骨关节炎(Osteoarthritis，OA)是一种退行性疾病，伴有一系列代谢变化和酶的改变。本研究报道了二甲基精氨酸二甲氨基水解酶-1(dimethylarginine dimethylaminohydrolase-1, DDAH1)的下调伴随着变性软骨细胞和OA样本中不对称二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine, ADMA)的增加。整体或条件性敲除软骨细胞的ADMA水解酶DDAH1加速了小鼠OA的发展。ADMA诱导软骨细胞变性和衰老，减少细胞外基质沉积，从而加速OA的进展。ADMA同时与SOX9及其去泛素化酶USP7结合，阻断USP7对SOX9的去泛素化作用，从而导致SOX9降解。OA患者滑液中ADMA水平升高，对OA诊断具有良好的敏感性和特异性的预测价值。因此，激活DDAH1以降低ADMA水平可能是OA治疗的潜在治疗策略。

技术路线

 

研究结果

01 骨性关节炎软骨细胞中ADMA升高会引发软骨变性

针对6名OA患者和6名相对健康的患者（膝关节骨折，无OA病史）开展代谢组学分析，两组出现一系列的代谢物差异。在上调TOP25的代谢物中，ADMA具有最高的统计学显著性，其异构体对称二甲基精氨酸(Symmetric dimethylarginine, SDMA)没有实质性变化（图1 B）。为了研究ADMA是否能在体内诱导OA，作者在内侧半月板失稳(destabilization of the medial Meniscus, DMM)手术1周后将ADMA直接注射到小鼠膝关节。ADMA在DMM手术中显著加速软骨退变，促进骨赘形成。此外，免疫组织化学染色证实，暴露于ADMA的软骨中II型胶原和聚集蛋白的表达降低。热板分析、旋转杆实验和野外实验显示，注射ADMA的小鼠疼痛阈值和移动能力明显降低。总之，这些数据表明，退化软骨细胞中ADMA的增加会引发软骨变性和衰老。

02DDAH1下调导致OA患者ADMA升高

ADMA是在精氨酸与甲基化残基的蛋白分解过程中释放出来的，随后被DDAH家族或AGXT2水解。作者使用DDAH1抑制剂PD 404182来探究DDAH1在OA中的作用。结果显示ADMA在PD 404182处理的软骨细胞中急剧升高（图1 C）。此外，ADMA在DDAH1−/−（DDAH1全基因敲除小鼠）原代软骨细胞中升高（图1 D）。这些数据表明，DDAH1在OA进展中受到抑制，从而增加了软骨细胞中的ADMA水平。此外，Western blotting和免疫组织化学验证了DDAH1的缺失（图1 H）。微团培养和3D琼脂糖培养显示，DDAH1−/−原代软骨细胞中ECM沉积较低（图1 E、F）。虽然在20周龄的DDAH1 - / -小鼠中没有观察到明显的OA相关表型，但DDAH1缺失明显加速了DMM诱导的OA小鼠的软骨退变（图1 G）。免疫组织化学显示，DDAH1 - / -小鼠软骨中的II型胶原和聚集蛋白减少（图1 H），可以确定ADMA在DDAH1的作用下可以快速水解。

 

图1. DDAH1上调ADMA加速OA进程

03软骨特异性DDAH1参与骨关节炎进展

为了进一步研究DDAH1的作用，作者建立DDAH1fl/fl（DDAH1条件敲除小鼠）小鼠模型，发现在软骨细胞中ADMA表现出高表达状态。RT-PCR结果显示合成代谢因子（COL2A1和ACAN）降低，分解代谢因子（MMP3和MMP13）升高（图2 A）；此外，DDAH1缺失后，aggrecan和COL2A1的蛋白表达显著下调（图2 B）。为了排除DDAH1对骨骼的影响，作者使用Col2-CreERT2和ACAN-CreERT2小鼠产生DDAH1条件敲除小鼠，使软骨细胞中DDAH1基因条件缺失。与对照组相比，软骨中DDAH1的缺失会导致DMM手术后更严重的软骨损伤（图2 C）。此外，DDAH1fl/fl、Col2-CreERT2和DDAH1fl/fl、ACAN-CreERT2小鼠软骨中II型胶原蛋白和聚集蛋白的表达明显降低（图2 D）。

同时，在DDAH1fl/fl, Col2-CreERT2和DDAH1fl/fl, ACAN-CreERT2小鼠中观察到更多的骨赘（图2 E）。作者也对软骨下骨密度进行了研究，发现DDAH1fl/fl, Col2-CreERT2和DDAH1fl/fl, ACANCreERT2小鼠均表现出更高的软骨下骨体积（图2 F）。热板、旋转杆和野外实验表明，DDAH1fl/fl、Col2-CreERT2和DDAH1fl/fl、ACAN-CreERT2小鼠对疼痛更敏感，并有一定程度的运动障碍（图2 G）。LC-MS证实了DDAH1过表达的软骨细胞中ADMA水平降低。说明DDAH1可部分逆转DMM诱导的小鼠骨性关节炎。

 

图2. 特异性敲除DDAH1加速OA发展

04ADMA激活SOX9的泛素-蛋白体途径

ADMA作为一种内源性一氧化氮合酶抑制物，可以通过NO影响病理生理过程，通过实验证明ADMA诱导软骨细胞退变不依赖于NOS/NO途径。为了更好地了解ADMA诱导软骨细胞变性机制，作者对ADMA处理的细胞进行了TMT定量蛋白质组学研究（上海百趣生物提供）。KEGG分析揭示了几种丰富的OA相关通路，如ECM受体相互作用、TNF信号通路、细胞衰老和糖胺聚糖生物合成（图3 A）。

火山图显示，分解代谢因子（MMP3和MMP13）、衰老标志物(P21)和炎症趋化因子（CCL2、CCL5和CXCL10）上调，合成代谢因子（aggrecan、COL2A1和SOX9）下调（图3 B)。先前的一项研究表明，SOX9缺乏导致健康软骨蛋白聚糖丢失，并导致创伤性OA后严重的软骨侵蚀。作者接下来重点关注SOX9是否是ADMA影响的核心蛋白。RT-PCR显示，DDAH1的缺失没有显著改变SOX9 RNA水平（图3 C）。然而，暴露于ADMA或DDAH1缺失的软骨细胞中，SOX9蛋白表达显著下调（图3 D和3 E）。

此外，免疫组织化学表明，关节注射PD 404182的小鼠（图3 F）或DDAH1fl/fl, Col2-CreERT2和DDAH1fl/fl, ACAN-CreERT2小鼠的软骨中SOX9的表达急剧下降（图3 G、 H）。此外，暴露于ADMA的细胞中SOX9的半衰期比对照细胞短，表明ADMA导致SOX9的不稳定性。MG132（一种蛋白酶体抑制剂）处理阻断了SOX9的降解，而氯喹（一种溶酶体抑制剂）则没有，这表明SOX9的降解依赖于蛋白酶体而不是溶酶体途径（图3 I、J）。此外，ADMA诱导的SOX9降解在过表达DDAH1的软骨细胞中部分逆转（图3 K）。值得注意的是，ADMA增加了泛素化SOX9的水平（图3 L）。总之，ADMA通过泛素-蛋白酶体途径触发SOX9降解。

 

图3. ADMA通过泛素-蛋白酶体途径诱导SOX9降解

05ADMA阻断SOX9和USP7之间的相互作用

在证明ADMA通过泛素-蛋白酶体途径加速SOX9降解后，作者下一步的目标是确定ADMA如何影响SOX9水平。作者合成了生物素-ADMA，将其与软骨细胞培养液培养，质谱检测，结合UbiBrowser数据库，预测了SOX9相关E3泛素连接酶或去泛素化酶(Deubiqui-tinating enzymes, DUBs)特异性相互作用的蛋白质，发现DUB USP7可能参与其中（图4 A、B）。免疫沉淀结果显示USP7能够降低泛素化的SOX9。通过Western blotting验证了USP7和ADMA之间的相互作用。质谱结果显示ADMA与SOX9相互作用，Western blotting进一步证实了这一点。

那么，进一步探讨ADMA是否与这两种蛋白质直接结合，系列分子实验结果表明，ADMA能够与SOX9和USP7之间的相互作用区域结合，主要是阻止它们的结合。免疫共沉淀证实了SOX9和USP7之间的相互作用，而ADMA可以削弱这种相互作用（图4  C~J）。为了证实猜想准确性，抑制USP7后，ADMA不影响SOX9的表达和对SOX9的泛素化。这些结果证实了ADMA阻断USP7对SOX9去泛素化作用。

 

图4. ADMA阻断SOX9和USP7之间的相互作用

06滑液中的ADMA是一种潜在的OA诊断标志物

为了研究ADMA在人类滑膜液中是否增加，作者进行了回顾性研究（图5 A）。根据纳入标准，纳入350例OA患者(n = 114 in center1, n = 112 in center 2, and n = 124 in center 3)，并根据Kellgren-Lawrence (KL)分级分为轻度、中度和重度3个阶段（图5 B）。考虑到OA是一种与年龄相关的退行性疾病，三个阶段的患者在性别、身高、体重和身体质量指数(BMI)方面没有明显差异，但年龄略有差异（图5 C）。

和预期一样，与相对健康的患者相比，OA患者滑液中表现为主要ADMA增加，而SDMA没有表现出临床意义。严重OA患者滑液中ADMA水平明显高于中度OA患者（图5 D），表明ADMA可能与OA进展呈正相关。根据Pearson相关分析，滑液中的ADMA与膝关节社会评分（膝关节OA的临床评估评分）（图5 E）和最小内侧关节间隙宽度(x线测量关节间隙狭窄和评估OA的关键指标)呈负相关（图5 F）。此外，ADMA与年龄有轻微的正相关，与BMI无关（图5 G、H）。受试者工作特征(ROC)曲线显示，滑液ADMA能将OA患者与相对健康的患者区分开来，有利于OA的早期诊断，具有良好的敏感性和特异性；但是，不能鉴别晚期OA和早期OA（图5 I）。这些数据表明，滑液中的ADMA可能是OA诊断的潜在标志物。

 

图5. ADMA在人类滑膜液中的变化结果

总结

本文中，研究团队在退化的软骨细胞中发现了新的生物标志物ADMA，ADMA的增加伴随着DDAH1的下调。在DDAH1的调节下，ADMA促进软骨细胞和软骨的退变与衰老，从而加速OA的进展，而不依赖于NOS/NO途径。相反，ADMA直接结合SOX9和USP7并阻断它们的相互作用区域，通过泛素-蛋白酶体途径促进SOX9降解。因此，靶向DDAH1可能为OA治疗提供新的方向。