免疫共沉淀质谱法Co-IP/MS是一种由免疫共沉淀技术联用质谱技术的蛋白互作研究技术具备高分辨率鉴定和精确定量蛋白质复合物中每个组分的优势。Co-IP/MS使用靶向目标蛋白的特异性抗体选择性地捕获目标蛋白质与其相互作用的分子进行免疫共沉淀然后使用LC-MS/MS鉴定和定量这些复合物中的单个蛋白质。通过一次分析多个样品可绘制出复杂的蛋白质相互作用网络帮助研究人员识别和表征蛋白质相互作用。除了研究静态蛋白质相互作用还能够捕获和识别在信号传导或环境信号响应下发生变化的动态蛋白复合物。技术流程技术应用1. 蛋白质复合物的鉴定用于揭示分子复合物的组成包括参与信号传导、转录调控和细胞转运等过程的多亚基复合物。如用于鉴定剪接体、染色质重塑复合物和核糖体亚基的组分。2. 构建蛋白质相互作用网络通过生物信息学工具分析数据构建蛋白相互作用网络。这些网络可用于识别枢纽具有许多互作的中心蛋白质、模块互作蛋白质组群或调控细胞功能的关键调节因子。根据蛋白质的互作图谱为其分配功能注释这对于特征不明确或新发现的蛋白质富有价值。3. 疾病研究1靶点识别与验证研究人员能够检测和鉴定药物靶点从而确认在疾病通路中发挥关键作用的特定蛋白质识别癌症细胞中的异常蛋白质互作提供潜在的诊断生物标志物和新的治疗干预靶点。2理解疾病机制通过揭示蛋白质在细胞网络中的相互作用和功能为疾病的分子机制提供了深入见解。这种理解对于开发能够有效调节这些通路的药物至关重要。3生物标志物的发现通过识别疾病状态下差异表达或修饰的蛋白质使生物标志物的发现和验证成为可能。这些生物标志物可用于患者分层、个性化治疗以及改善临床结果。4. 蛋白质修饰研究富集蛋白复合物后结合高分辨率质谱分析能够精确地鉴定共沉淀蛋白的修饰类型和位点例如磷酸化、乙酰化、泛素化、糖基化等。这种方法不仅可以揭示目标蛋白自身的修饰状态还能鉴定与其相互作用蛋白的修饰情况从而理解蛋白质修饰在蛋白质互作调控中的作用。此外结合定量质谱技术还可以比较不同条件下蛋白质修饰水平的变化例如在细胞受到刺激后或疾病状态下更深入地理解修饰在蛋白质功能和调控机制中的动态作用。5. 联合其它组学整合基因组学、转录组学等数据提供分子图谱的全面视图能够系统地了解生物过程。这种多维分析可以识别导致细胞功能复杂性的功能模块、蛋白质复合物和调节网络。送样要求1. 提供IP级的抗体2. 细胞用胰酶消化下来常温1500 rpm离心5 min去掉培养基加入PBS洗涤一次收集起来PBS洗涤一次常温1500rpm离心5 min去PBS用吸头吸干PBS-80℃冻存。一次IPIgG需要提供1×10^7个细胞3. 运输条件干冰运输4. ≥2个样本起做至少≥2个replicates研究案例1、心肌再生的RNA调控Adv SciRNA-Binding Protein Hnrnpa1 Triggers Daughter Cardiomyocyte Formation by Promoting Cardiomyocyte Dedifferentiation and Cell Cycle Activity in a Post-Transcriptional Manner【1】这篇文章通过分析新生和成年小鼠心脏的单核RNA测序数据识别出RNA结合蛋白Hnrnpa1作为潜在的心肌细胞增殖调控因子并通过体内外功能获得和缺失实验验证了其促进心肌细胞去分化和细胞周期活性的作用。在机制研究中通过Nanopore测序、RIP实验、PAR-CLIP等方法发现Hnrnpa1可以调控Mettl3的可变剪接。特别是通过Co-IP/MS实验发现Mettl3-S可以与Mettl3-L相互作用并抑制其甲基转移酶活性揭示了一个新的调控机制Hnrnpa1通过增加Mettl3-S/Mettl3-L比例抑制m6A依赖的Pbx1和E2F1降解从而促进心肌细胞去分化和增殖为心肌梗死后的心脏再生提供了新的治疗靶点。2、化疗耐药机制研究TheranosticsBisecting GlcNAc modification reverses the chemoresistance via attenuating the function of P-gp【2】这篇文章研究了双分支N-乙酰葡糖胺bisecting GlcNAc修饰如何通过调控P-糖蛋白P-gp的功能来逆转化疗耐药性。研究通过生物信息学分析、临床样本验证、细胞和动物实验、质谱分析和结构动力学分析等多种方法系统地阐明了bisecting GlcNAc的作用机制。其中Co-IP/MS被用于两个关键发现一是发现了Trim21是调控MGAT3降解的E3泛素连接酶揭示了化疗药物通过Trim21介导的蛋白酶体途径降解MGAT3的机制二是鉴定出ERM家族蛋白特别是ezrin是P-gp的重要相互作用蛋白并发现bisecting GlcNAc通过影响P-gp与ezrin的相互作用来调控P-gp的膜定位从而影响其功能。这些发现阐明了bisecting GlcNAc调控化疗耐药的分子机制也为开发靶向糖基化修饰的抗耐药策略提供了新思路。3、少突胶质细胞瘤致病机制研究Neuro OncolTRIM67 drives tumorigenesis in oligodendrogliomasthrough Rho GTPase-dependent membrane blebbing【3】这篇文章研究了TRIM67在少突胶质细胞瘤中的致癌作用及其分子机制。研究通过RNA测序、全细胞裂解液质谱、Co-IP/MS、免疫荧光染色、Western blot和原位移植模型等多种方法系统地阐明了TRIM67的作用机制。其中Co-IP/MS主要用于鉴定TRIM67的相互作用蛋白网络结果发现TRIM67主要与细胞骨架/细胞黏附相关蛋白相互作用这些蛋白主要涉及细胞骨架、内吞、细胞黏附和细胞连接等功能。进一步研究发现TRIM67通过NOGO-A/Rho GTPase/ROCK信号通路诱导细胞膜泡形成从而降低细胞黏附、增加细胞迁移能力最终促进肿瘤生长。这些发现揭示了TRIM67在少突胶质细胞瘤发病机制中的关键作用。4、非酒精性脂肪性肝炎发病机制研究GastroenterologySqualene Epoxidase Induces Nonalcoholic Steatohepatitis Via Binding to Carbonic Anhydrase III and is a Therapeutic Target【4】这篇文章研究了角鲨烯环氧化酶SQLE在非酒精性脂肪性肝炎NASH发病机制中的作用。研究通过肝细胞特异性SQLE过表达小鼠模型、高脂高胆固醇饮食诱导的NASH模型、甲硫氨酸-胆碱缺乏饮食诱导的NASH模型以及Western blot、免疫组化、RNA测序等多种方法系统研究了SQLE的功能和机制。其中研究者使用Co-IP/MS分析鉴定SQLE的相互作用蛋白发现碳酸酐酶IIICA3是SQLE的直接结合蛋白。进一步研究发现SQLE通过与CA3的相互作用稳定CA3蛋白促进脂肪生成和炎症反应从而加速NASH的发展。这一发现不仅揭示了SQLE/CA3轴在NASH发病机制中的关键作用也为NASH的治疗提供了新的靶点同时血清中SQLE和CA3的水平可作为NASH诊断的新型生物标志物。5、头颈部鳞状细胞癌顺铂耐药机制研究J Exp Clin Cancer ResTNFAIP2 confers cisplatin resistance in headand neck squamous cell carcinoma via KEAP1/NRF2 signaling【5】这篇文章主要研究了TNFAIP2在头颈部鳞状细胞癌HNSCC顺铂耐药中的作用机制。研究者通过临床样本分析、体外细胞实验包括CCK-8、集落形成、流式细胞术等和体内动物模型裸鼠移植瘤模型和4NQO诱导的HNSCC小鼠模型系统地研究了TNFAIP2的功能。其中为了探究TNFAIP2促进顺铂耐药的分子机制研究者使用Co-IP/MS分析TNFAIP2的相互作用蛋白发现KEAP1是TNFAIP2的直接结合蛋白。进一步研究发现TNFAIP2通过其DLG基序与KEAP1的Kelch结构域结合竞争性地阻止了KEAP1与NRF2的相互作用从而防止NRF2被泛素化降解。这导致NRF2蛋白稳定和累积激活抗氧化应答抑制ROS/JNK通路介导的细胞凋亡最终导致顺铂耐药。这一发现不仅阐明了TNFAIP2/KEAP1/NRF2/JNK轴在HNSCC顺铂耐药中的关键作用也为克服HNSCC顺铂耐药提供了潜在的治疗靶点。6、胆管癌化疗耐药机制J Exp Clin Cancer ResMBD2 regulates the progression and chemoresistance of cholangiocarcinoma through interaction with WDR5【6】这篇文章主要研究了MBD2在胆管癌中的作用机制。研究者通过生物信息学分析、免疫组化、细胞实验和动物实验等方法发现MBD2在胆管癌组织中高表达,且与患者预后相关。通过体外细胞实验CCK-8、克隆形成、伤口愈合实验等和体内动物实验皮下移植瘤和原发性胆管癌小鼠模型证实MBD2可以促进胆管癌的增殖、迁移和化疗耐药。为了探究MBD2促进ABCB1表达的具体分子机制,研究者使用了Co-IP/MS分析MBD2的相互作用蛋白,发现了WDR5这个关键分子。进一步研究表明MBD2可以通过其GR-rich区域直接与WDR5结合,招募WDR5-KMT2A复合物到ABCB1启动子区域,通过催化H3K4三甲基化来激活ABCB1的转录,从而促进胆管癌的化疗耐药。最后研究者还发现WDR5-KMT2A抑制剂MM-102可以有效抑制这一通路,增加胆管癌对顺铂的敏感性。7、糖尿病外周动脉疾病的治疗研究Cardiovasc DiabetolAdipsin improves diabetic hindlimb ischemia through SERPINE1 dependent angiogenesis【7】这篇文章主要研究了脂肪因子Adipsin在糖尿病小鼠后肢缺血中的治疗作用及其分子机制。研究者通过建立高脂饮食/链脲佐菌素HFD/STZ诱导的2型糖尿病小鼠模型和特异性过表达Adipsin的转基因小鼠模型结合后肢缺血手术发现Adipsin可以促进血流恢复、血管新生和组织再生。体外实验证实Adipsin可以促进人脐静脉内皮细胞HUVECs在高糖和缺氧条件下的增殖、迁移和管腔形成。其中为了探究Adipsin促进血管新生的分子机制文章使用了Co-IP/MS分析来寻找与Adipsin相互作用的蛋白。分析发现SERBP1SERPINE1 mRNA结合蛋白1是Adipsin的重要结合蛋白。进一步研究表明Adipsin通过与SERBP1结合干扰了SERBP1与SERPINE1 mRNA的相互作用从而降低SERPINE1 mRNA的稳定性和表达水平。SERPINE1表达的降低促进了VEGF诱导的VEGFR2活化最终促进血管新生。这一发现阐明了Adipsin促进血管新生的新机制为糖尿病患者外周动脉疾病的治疗提供了新的潜在靶点。表观生物TEL400-775-0875参考文献[1] Li C, Chen Y, Chen Q, et al. RNA-Binding Protein Hnrnpa1 Triggers Daughter Cardiomyocyte Formation by Promoting Cardiomyocyte Dedifferentiation and Cell Cycle Activity in a Post-Transcriptional Manner. Adv Sci (Weinh). Published online November 19, 2024.[2] Tan Z, Ning L, Cao L, et al. Bisecting GlcNAc modification reverses the chemoresistance via attenuating the function of P-gp. Theranostics. 2024;14(13):5184-5199. Published 2024 Aug 19.[3] Demirdizen E, Al-Ali R, Narayanan A, et al. TRIM67 drives tumorigenesis in oligodendrogliomas through Rho GTPase-dependent membrane blebbing. Neuro Oncol. 2023;25(6):1031-1043.[4] Liu D, Wong CC, Zhou Y, et al. Squalene Epoxidase Induces Nonalcoholic Steatohepatitis Via Binding to Carbonic Anhydrase III and is a Therapeutic Target. Gastroenterology. 2021;160(7):2467-2482.e3.[5] Xu T, Yang Y, Chen Z, et al. TNFAIP2 confers cisplatin resistance in head and neck squamous cell carcinoma via KEAP1/NRF2 signaling. J Exp Clin Cancer Res. 2023;42(1):190. Published 2023 Aug 1.[6] Wang D, Chen J, Wu G, et al. MBD2 regulates the progression and chemoresistance of cholangiocarcinoma through interaction with WDR5. J Exp Clin Cancer Res. 2024;43(1):272. Published 2024 Sep 30.[7] Zhang X, Jiang M, Zhang X, et al. Adipsin improves diabetic hindlimb ischemia through SERPINE1 dependent angiogenesis. Cardiovasc Diabetol. 2024;23(1):429. Published 2024 Dec 2.