摘要传统单一肝细胞模型在药物肝毒性评价、NASH机制研究以及肝纤维化研究中长期存在体外快速去分化、病理表型不完整以及与临床结果偏差较大的问题。近年来人肝非实质细胞Hepatic Non-Parenchymal CellsNPC逐渐成为构建高生理相关性肝脏模型的重要组成部分。本文系统解析肝NPC的定义、核心分类、功能特点以及在ADME-Tox、NAFLD/NASH、肝纤维化、3D肝类器官以及生物人工肝中的应用价值并重点介绍Kupffer Cells、肝星状细胞HSCs与肝窦内皮细胞LSECs如何共同重建更接近体内真实环境的肝脏微环境。关键词人肝非实质细胞、肝NPC、Kupffer Cells、肝星状细胞、LSECs、人原代肝细胞、肝病研究、NASH模型、肝纤维化、ADME-Tox、3D肝模型、LifeNet Health一、为什么传统单一肝细胞模型越来越难满足现代肝病研究需求在药物研发、肝病机制研究以及肝毒性评价领域传统单一原代肝细胞模型曾长期作为体外实验的重要基础工具。然而随着NAFLD/NASH、肝纤维化、免疫介导性肝损伤以及复杂肝脏疾病研究不断深入研究人员逐渐发现仅依赖单一肝细胞模型已经难以真实复现体内肝脏复杂微环境。其中最常见的问题包括原代肝细胞在体外培养过程中快速去分化代谢酶表达水平迅速下降药物转运功能逐渐丢失实验窗口期较短同时单一肝细胞模型无法完整复现肝脏炎症、免疫调控、纤维化以及细胞间相互作用等核心病理过程因此很多在体外模型中表现良好的候选药物在后续动物实验甚至临床研究中却表现不佳。造成这些问题的核心原因在于传统模型忽略了肝脏微环境中的关键调控细胞群也就是人肝非实质细胞Hepatic Non-Parenchymal CellsNPC。这些细胞虽然不直接承担主要代谢功能但却是维持肝脏稳态、调控炎症反应、参与肝纤维化进程以及维持肝细胞功能的重要核心组分。如今越来越多研究开始意识到想要真正建立高生理相关性的体外肝脏模型仅有肝细胞远远不够必须同时引入肝NPC共同构建接近体内真实环境的肝脏微生态体系。二、什么是人肝非实质细胞NPC肝脏细胞主要可分为两大功能群体第一类是占肝脏体积约80%的肝实质细胞也就是成熟肝细胞其主要负责药物代谢、蛋白合成、解毒以及能量代谢等核心生理功能第二类则是肝非实质细胞NPCs即除肝细胞外所有构成肝脏微环境的重要细胞群体。虽然NPC在体积上占比较低但其数量约占肝脏细胞总数的30%~40%并且是肝脏炎症、免疫调控、损伤修复以及纤维化过程中的核心调控者。相比单纯承担代谢功能的肝细胞NPC更像是肝脏微环境中的“调度中心”负责协调肝脏与免疫系统、循环系统以及细胞外基质之间的复杂互作。在人类肝脏中NPC主要包括库普弗细胞Kupffer CellsKCs肝星状细胞Hepatic Stellate CellsHSCs肝窦内皮细胞Liver Sinusoidal Endothelial CellsLSECs这些细胞通过旁分泌信号、细胞间接触以及细胞外基质调控共同维持肝脏稳态同时参与肝病发生发展的全过程。图1. 肝脏代表性细胞类型及其在健康与疾病状态下的旁分泌与自分泌信号网络三、Kupffer Cells为什么是肝脏免疫研究的重要核心Kupffer Cells是定居于肝血窦中的肝脏常驻巨噬细胞也是肝脏固有免疫系统的核心组成部分。其主要负责识别病原体、吞噬异物、清除死亡细胞以及调控炎症反应。研究发现Kupffer Cells不仅参与日常免疫稳态维持同时也是药物性肝损伤DILI、NASH炎症以及肝纤维化的重要驱动者。尤其是在免疫介导性药物肝损伤iDILI中很多临床毒性实际上并不是药物直接作用于肝细胞导致而是通过Kupffer Cells介导的免疫炎症反应引发。传统单一肝细胞模型由于缺乏Kupffer Cells因此无法完整模拟这类免疫相关肝毒性这也是很多药物体外毒性评价与临床结果差异较大的重要原因之一。图2. 人库普弗细胞Kupffer Cells此外在NAFLD/NASH研究中Kupffer Cells还是炎症级联反应的重要启动者。单一肝细胞模型通常只能诱导脂肪变性而难以进一步复现炎症和纤维化过程而当引入Kupffer Cells后模型则能够更真实地模拟NASH疾病进展中的免疫炎症特征。同时Kupffer Cells还能通过释放TGF-β等细胞因子激活肝星状细胞进一步促进胶原沉积和纤维化形成因此也是抗纤维化药物开发中的重要研究对象。四、肝星状细胞HSCs为什么是肝纤维化研究的关键肝星状细胞HSCs位于肝细胞与肝窦内皮细胞之间的Disse间隙是肝纤维化研究领域最重要的核心细胞之一。在正常状态下HSCs主要负责储存维生素A并维持细胞外基质ECM稳态。然而当肝脏受到慢性炎症、病毒感染、脂肪沉积或者药物刺激后HSCs会被激活并逐渐转化为肌成纤维样细胞随后大量合成胶原蛋白和ECM成分最终导致肝纤维化甚至肝硬化发生。因此HSCs实际上是肝纤维化形成过程中最核心的“效应细胞”。图3. 人肝星状细胞Hepatic Stellate CellsHSCs近年来大量抗肝纤维化药物开发项目都围绕HSCs活化机制展开包括TGF-β信号通路ECM重塑炎症调控ROS氧化应激肝癌微环境重塑等多个方向。此外研究人员也发现HSCs不仅参与纤维化还会通过调控肿瘤微环境影响肝癌细胞增殖、侵袭与转移因此在肝癌研究中同样具有重要意义。五、LSECs如何决定肝脏模型的生理真实性肝窦内皮细胞LSECs是覆盖于肝血窦内壁的特化内皮细胞其最显著特点是具有大量纳米级窗孔结构并且缺乏传统连续型基底膜。这种特殊结构使LSECs成为肝脏与血液循环之间的重要物质交换屏障。图4. 肝窦内皮细胞Liver Sinusoidal Endothelial CellsLSECsLSECs不仅参与药物摄取、代谢与转运同时还能通过旁分泌HGF、VEGF等因子维持肝细胞分化状态。研究表明当肝细胞与LSECs共同培养时肝细胞的代谢酶表达与功能维持时间能够明显延长部分模型中甚至可将稳定培养时间从传统7天延长至14天以上。此外在肝纤维化早期LSECs窗孔消失与毛细血管化也是诱导HSCs活化的重要触发事件因此LSECs同样是抗纤维化研究的重要靶点。六、肝NPC如何提升ADME-Tox与药物肝毒性研究准确性在传统ADME-Tox研究中很多模型仅使用单一肝细胞进行药物代谢与毒性评价但这种方式很难完整模拟体内真实肝脏环境。例如LSECs参与药物摄取与转运Kupffer Cells参与免疫炎症反应HSCs参与损伤后纤维化过程如果缺少这些细胞很多复杂毒性机制就无法被正确识别。因此目前越来越多高生理相关性肝毒性模型开始采用肝细胞 LSECs肝细胞 Kupffer Cells肝细胞 HSCs四细胞共培养体系等方案。其中多细胞共培养模型能够更完整模拟药物摄取肝内转运炎症反应免疫介导毒性ECM重塑纤维化进程等复杂生理过程。目前FDA与EMA也越来越推荐使用高生理相关性的多细胞肝脏模型进行药物肝毒性评价。七、为什么NASH研究越来越依赖肝NPCNAFLD/NASH是当前全球增长最快的慢性肝病之一其核心病理特征包括脂肪变性炎症气球样变纤维化然而传统单一肝细胞模型通常只能诱导脂肪沉积而难以完整复现炎症与纤维化过程。因此目前主流NASH模型越来越倾向于采用肝细胞Kupffer CellsHSCsLSECs共同构建四细胞共培养体系。该体系能够更加真实地模拟NASH从脂肪沉积到慢性炎症再到纤维化发展的完整病理过程因此也逐渐成为抗NASH药物筛选的重要标准模型。八、肝NPC在3D肝类器官与生物人工肝中的应用近年来3D肝脏类器官与生物人工肝技术快速发展但研究人员逐渐发现仅依赖单一肝细胞构建的3D模型往往存在功能维持时间短、结构稳定性差以及长期培养困难等问题。而引入NPC后可以显著改善肝细胞分化状态ECM稳定性细胞间通讯长期代谢功能等多个方面。尤其是在3D肝类器官中NPC能够帮助重建更真实的肝脏微环境使模型更加接近体内状态。同时在生物人工肝领域肝细胞与NPC联合培养体系也被认为是未来提高解毒效率与长期功能稳定性的关键方向之一。更多人肝NPC与原代肝细胞相关资料也可参考https://www.mine-bio.com/LifeNet_PrimaryCells_Medium/LifeNet_NPCs.shtml?utm_sourcecsdnutm_mediumreferralutm_campaignlifenet_article九、总结随着肝病研究与新药开发不断深入传统单一肝细胞模型的局限性正在越来越明显地暴露出来。相比之下包含Kupffer Cells、肝星状细胞以及LSECs在内的肝NPC体系能够更真实地重建肝脏微环境并显著提升体外模型的生理相关性。无论是在ADME-Tox、DILI、NAFLD/NASH、肝纤维化还是3D肝类器官研究中肝NPC都正在成为不可或缺的重要组成部分。对于希望提升模型稳定性、增强临床相关性以及提高药物筛选准确性的研究人员而言基于原代肝细胞与NPC构建的多细胞体系已经逐渐成为下一代肝病研究的重要方向。FAQ肝非实质细胞NPC常见问题Q1什么是肝非实质细胞NPC肝非实质细胞是指除肝细胞外所有参与构成肝脏微环境的重要细胞群体包括Kupffer Cells、肝星状细胞以及LSECs等。Q2为什么单一肝细胞模型越来越不够用因为单一模型无法完整模拟炎症、免疫反应、纤维化以及细胞间通讯因此很多实验结果与临床实际情况差异较大。Q3Kupffer Cells在NASH研究中有什么作用Kupffer Cells是NASH炎症级联反应的重要启动者参与炎症因子释放以及HSCs活化。Q4为什么HSCs是抗纤维化研究核心因为HSCs活化后会大量产生胶原蛋白与ECM是肝纤维化形成的关键驱动细胞。Q5LSECs为什么能延长肝细胞培养时间LSECs能够分泌HGF、VEGF等因子维持肝细胞分化状态从而延缓体外去分化过程。关于技术资料来源本文内容基于人肝非实质细胞、人原代肝细胞、肝NPC、肝毒性等公开科研资料、应用文献等内容曼博生物整理仅用于科研技术交流。