引言做相分离研究最让人头疼的问题往往是第一步我该从哪里下手找到那些真正参与相分离的蛋白液-液相分离LLPS作为细胞内无膜细胞器形成的核心机制这几年热度一直不减。但真正上手做的时候大家面临的难题其实很实在 —— 相分离蛋白富含低复杂度结构域LCD相互作用依赖弱多价力形成的凝聚体又是高度动态、转瞬即逝的结构。目前还没有一个公认的、能高通量无偏倚地从全蛋白组里“海选”潜在选手的方法。面对这个困境近几年摸索出了几条可行的路子一是利用LCD本身的理化特性去富集二是反向破坏弱相互作用再看谁跑了三是在活细胞里用邻近标记把空间邻居都标出来。今天就结合几篇代表性文献把这三种策略的思路和应用场景梳理一下希望能大家的实验设计提供一些参考。策略一利用LCD特性 —— b-isox无细胞富集法技术原理b-isox生物素化异恶唑衍生物是一种巧妙利用相分离蛋白自身特性的工具。在低于4°C的环境中b-isox分子会自发组装形成微米级微晶结构。这些微晶表面可作为“种子”特异性吸引含有低复杂度结构域或内在无序区域IDR的蛋白聚集促使其发生聚合和相分离最终形成可离心沉淀的复合物。操作流程①制备细胞或组织裂解液②在4°C条件下加入b-isox诱导相分离蛋白沉淀③离心收集沉淀洗涤去除非特异性结合④质谱鉴定富集的蛋白组分应用案例从动物到植物的跨越1.奠基性工作CellIF42.5研究者利用b-isox从多种小鼠组织和细胞系中富集出数百种RNA结合蛋白。进一步体外实验证实纯化的LC结构域蛋白可从可溶态自发转变为水凝胶纤维。这项工作明确了一个核心结论低复杂度序列是蛋白相分离的必要条件。2.植物领域拓展Molecular PlantIF24.1在拟南芥中应用b-isox筛选成功鉴定出985个潜在相分离蛋白ProX涵盖不同组织和胁迫状态下的蛋白组。这证明该技术在植物系统中同样高效可靠。技术要点提示操作中需严格控制低温环境4°C沉淀洗涤步骤应轻柔避免破坏微晶-蛋白间的弱相互作用。策略二邻近标记 —— TurboID-MS活细胞原位鉴定技术原理TurboID是一种高效的生物素连接酶突变体可在活细胞内实现邻近蛋白标记。在添加生物素和ATP的条件下TurboID能将生物素高效转移至其周围约10nm范围内的蛋白赖氨酸残基上。通过链霉亲和素磁珠富集生物素化蛋白结合质谱即可解析目标蛋白的“社交网络”。应用案例揭示多相凝聚体的边界调控者Nature Cell BiologyIF19.11.科学问题秀丽线虫生殖颗粒由P、Z、M三类多相凝聚体组成它们彼此相邻却互不融合。哪些蛋白负责维持这种“不混溶性”2.研究策略将TurboID分别融合至PGL-1P颗粒、ZNFX-1Z颗粒、MUT-16M颗粒核心蛋白邻近标记后富集鉴定互作蛋白组交叉分析发现HERD-1蛋白同时与三者互作却独立于任一类凝聚体3.关键发现免疫荧光证实HERD-1定位于各类凝聚体的界面区域是维持多相不相容性的关键调控因子。策略三破坏弱相互作用 —— Hi-MS己二醇鉴定法技术原理1,6-己二醇1,6-HD能够特异性溶解由疏水相互作用驱动的相分离凝聚体释放其中包裹的蛋白。Hi-MS技术的核心在于比较己二醇处理组与对照组的蛋白组分差异从而反向推导参与相分离的蛋白群体。操作流程以染色质相关凝聚体为例①甲醛交联固定染色质与凝聚体核心蛋白②温和裂解细胞保留凝聚体结构③对照组与1,6-HD处理组分别孵育④限制性内切酶切割DNA连接生物素寡核苷酸⑤链霉亲和素磁珠富集质谱鉴定差异蛋白应用案例靶向促癌转录因子的凝聚体NatureIF42.71.科学问题FOXM1是乳腺癌中高度活化的促癌转录因子它能否形成相分离凝聚体凝聚体状态是否影响其促癌功能能否以此作为治疗靶点2.研究路径Hi-MS鉴定发现FOXM1在乳腺癌细胞中形成染色质相关凝聚体FRAP和液滴融合实验证实其相分离特性结构域截短体分析锁定IDR1为关键驱动区域靶向破坏凝聚体可显著抑制肿瘤生长与转移这一研究为“靶向相分离凝聚体”的抗癌策略提供了概念验证。三类技术对比如何选择适合你的策略总结说到底相分离蛋白的分离与鉴定本质上就是抓住它两个最鲜明的特征做文章 —— 序列上偏爱LCD/IDR行为上依赖弱相互作用。b-isox盯住序列特征搞富集TurboID捕获空间邻近性来画“朋友圈”Hi-MS则通过破坏凝聚体验证行为依赖性。三套逻辑各有所长。在实操层面我们自己的体会是这三类技术很少会单独押宝在某一个上。比较顺手的路径往往是先用b-isox做个无偏好的初筛把候选池子圈出来再挑感兴趣的靶点用TurboID把它的互作网络和空间定位搞清楚最后上Hi-MS验证一下它在体内是不是真的靠相分离“干活”。这套组合拳走下来数据的说服力会扎实很多。当然每种方法都有各自的脾气和坑比如b-isox对低温的苛刻要求、TurboID的背景控制、Hi-MS对凝聚体类型的偏好性等等大家在设计实验时还是得结合自己的体系灵活调整。参考资料1. Kato M, Han TW, Xie S, et al. Cell-free formation of RNA granules: low complexity sequence domains form dynamic fibers within hydrogels. Cell. 2012;149(4):753-767. doi:10.1016/j.cell.2012.04.0172. Zhang H, Peng F, He C, Liu Y, Deng H, Fang X. Large-scale identification of potential phase-separation proteins from plants using a cell-free system. Mol Plant. 2023;16(2):310-313. doi:10.1016/j.molp.2022.11.0133. Zhao C, Cai S, Shi R, et al. HERD-1 mediates multiphase condensate immiscibility to regulate small RNA-driven transgenerational epigenetic inheritance. Nat Cell Biol. 2024;26(11):1958-1970. doi:10.1038/s41556-024-01514-84. Xie F, Zhou X, Ran Y, et al. Targeting FOXM1 condensates reduces breast tumour growth and metastasis. Nature. 2025;638(8052):1112-1121. doi:10.1038/s41586-024-08421-w