摘要表面等离子共振SPR是生物分子互作分析的核心技术本文以连翘活性成分筛选为案例详细讲解SPR 亲和力筛选的实验搭建、芯片偶联、垂钓富集、液质鉴定、分子模拟、动力学拟合全流程给出可工程化复现的技术方案适合生物信息、生物工程、药物研发工程师参考。1 技术背景在中药复杂体系中传统活性筛选方法存在纯化繁琐、标记干扰、假阳性高、无法定量等问题。SPR 无标记互作技术可直接在粗提体系中实现活性成分垂钓并定量检测亲和力KD、结合速率ka、解离速率kd为活性成分筛选提供客观量化指标已成为药物研发的关键底层技术。2 SPR 实验系统搭建2.1 芯片与蛋白偶联选用 CM5 传感芯片采用氨基偶联流程1EDC/NHS 混合液以 10 μL/min 流速激活芯片通道2靶蛋白用 pH 4.0 醋酸钠稀释至 50 μg/mL固定至芯片表面3乙醇胺封闭未反应位点完成蛋白固载4同步构建参比通道消除非特异性结合干扰。本实验蛋白偶联量达 8941 RU满足后续垂钓与亲和力检测要求。2.2 样品制备与 SPR 垂钓称取连翘药材水提后制成 500 mg/mL 浓缩液经滤膜除菌后稀释为 500、250、125 mg/mL 梯度浓度。样品以 10 μL/min 流速进样结合 60 s解离 60 s重复检测收集特异性结合洗脱液。结果显示RU 信号随样品浓度升高而增强呈现典型浓度依赖性结合证明体系存在特异性互作成分。3 活性成分质谱鉴定将 SPR 垂钓洗脱液经甲醇复溶、超声、离心、过滤后采用 Q Exactive Plus 高分辨液质联用仪检测正负离子模式同时扫描通过 Compound Discover 3.2 软件进行峰提取与结构鉴定。共鉴定出 9 种活性成分原儿茶酸、马钱苷酸、红景天苷、断氧化马钱苷、连翘酯苷 I、毛蕊花糖苷、茵芋苷、异连翘酯苷 A、桑黄素。4 分子水平结合验证4.1 分子对接对靶蛋白进行同源建模与去水优化小分子配体进行能量最小化处理采用 AutoDock Vina 进行对接计算结合亲和力。筛选结合能-5.0 kcal/mol 的成分进入下一步模拟。4.2 分子动力学模拟采用 AMBER 22 进行 100 ns 模拟蛋白用 ff14SB 力场小分子用 gaff 力场TIP3P 水盒子构建体系。计算 RMSD 与 MM-GBSA 结合自由能结果显示毛蕊花糖苷、异连翘酯苷 A、桑黄素结合自由能-10 kcal/mol体系稳定。5 SPR 亲和力定量检测核心环节5.1 单点筛选将 9 种候选成分配制成 100 μmol/L 初始浓度进样检测结合信号。结果显示所有成分均产生特异性结合信号毛蕊花糖苷、原儿茶酸信号幅值最高优先进入定量检测。5.2 动力学与亲和力拟合将毛蕊花糖苷倍比稀释为 0.1875~12 μmol/L 梯度浓度以 30 μL/min 流速进样采集结合 / 解离曲线。使用 Biacore T200 evaluation 软件采用1:1 Langmuir 结合模型全局拟合得到 KD3.24×10⁻⁶ M证明毛蕊花糖苷与靶蛋白具有高强度亲和力。6 技术优势与工程化价值1无标记原位检测直接在粗提体系筛选无需纯化适配中药复杂样品2定量亲和力输出提供 KD、ka、kd 等关键参数为药物筛选提供量化依据3高通量高效单次可完成多组分、多浓度检测大幅缩短研发周期4结果可靠结合分子模拟与体内验证降低假阳性。7 总结基于 SPR 亲和力的中药活性成分筛选体系将生物传感、质谱鉴定、计算模拟、功能验证有机结合形成标准化、可复现、可量化的研发流程。该方案可直接迁移至天然产物筛选、小分子互作、蛋白靶标验证等场景是生物工程与药物研发领域的高价值技术方案。参考文献王琳王平蔡雯等。基于 SPR 垂钓技术的连翘靶向 RSV-F 蛋白 “功效物质” 筛选 [J]. 世界科学技术 - 中医药现代化2025,27 (05):1405-1416.