有限蛋白水解质谱Limited Proteolysis-Mass SpectrometryLip-MS作为无标记、原位、高通量的以药找靶技术彻底打破传统技术壁垒直接在细胞、组织等天然体系中精准捕获药物结合的靶蛋白与结合位点成为当下药物靶点筛选的主流技术。相对DARTS、TPP和小分子Pull-down等传统靶点筛选技术Lip-MS具有如下优势1保持药物天然状态无需修饰避免修饰导致药物失效和靶点结合偏差2 原位真实可靠最大程度还原药物与蛋白的天然互作环境3 精准靶向不仅能筛选靶蛋白还能定位药物结合的肽段区域4 高通量无偏向不预设靶点适合盲筛未知靶点药物5 高通量无偏向不预设靶点适合盲筛未知靶点药物01 LiP-MS技术原理生理状态下蛋白质表面存在大量暴露的柔性区域这些区域是蛋白酶的优先切割位点。当药物分子与靶蛋白特异性结合时会通过氢键、疏水作用等非共价键稳定蛋白结构使结合区域的柔性位点被屏蔽蛋白酶难以切割形成“构象保护效应”。因此采用低浓度、短时间的有限酶切条件仅切割蛋白表面未被保护的柔性区域避免过度酶解破坏差异信号。药物处理组由于靶蛋白结合区域被保护对应肽段丰度显著升高溶剂对照组由于靶蛋白无药物结合表面位点被切割对应肽段丰度降低。最终通过液相色谱-串联质谱LC-MS/MS对两组肽段进行精准定量对比肽段丰度差异即可筛选出受药物保护的肽段反向定位对应的靶蛋白并映射到蛋白三维结构上确定结合位点。Pepelnjak M, et al., 202002LiP-MS技术流程1、采用非变性温和裂解方式提取细胞/组织总蛋白并通过BCA定量蛋白浓度2、设置药物处理组加入小分子药物和溶剂对照组加入等量溶剂25℃或37℃孵育0.5 - 2 h确保药物与靶蛋白充分结合3、分别加入低浓度蛋白酶K室温短时间孵育3-5 min然后立即高温灭活蛋白酶终止酶切反应4、加入变性剂打开蛋白二硫键经还原、烷基化处理用胰蛋白酶进行完全酶解将蛋白切割为适合质谱检测的小分子肽段5、通过C18色谱柱脱盐纯化去除盐离子、杂质避免干扰质谱检测6、将纯化的蛋白进行质谱鉴定筛选差异肽段并定位药物结合位点。03 技术对比04 应用案例1、Lip-MS鉴定丁酸钠与TGR5的结合位点巨噬细胞在溃疡性结肠炎UC的发病机制中起着重要作用。研究人员首先利用生信分析和SPR技术明确TGR5为丁酸钠的作用靶点随后利用Lip-MS技术和分子对接明确丁酸钠与TGR5的ASP-284和TYR-287形成氢键相互作用并最终通过细胞实验证实丁酸钠通过结合TGR5调控巨噬细胞极化。Miao L, et al., 20252、Lip-MS筛选磺胺罗汀靶蛋白肝内胆管癌ICC是一种高度致死的恶性肿瘤目前缺乏有效的临床治疗方法。磺胺罗汀是新开发的一种视黄醇SFT能够抑制增殖并诱导具有干细胞类特性的肿瘤再生细胞的凋亡。研究人员借助Lip-MS证实SFT通过诱导RARα入核抑制P-selectin蛋白表达。并直接结合FUT8抑制P-selectin蛋白配体PSGL1的岩藻糖基化最终导致细胞骨架受损诱发ICC的肿瘤再生细胞凋亡。Du X, et al., 20253、Lip-MS鉴定杜鹃素和UCHL3的相互作用杜鹃素是一种天然的类黄酮促进同源重组HR修复以提高基因组编辑效率但其分子机制及靶向蛋白尚未确定。研究人员借助Lip-MS技术发现去泛素酶UCHL3是杜鹃素的直接靶点。杜鹃素通过结合并增强UCHL3的去泛素酶活性促进RAD51去泛素化从而改善HR修复。Zhang W, et al., 2023参考文献[1] Pepelnjak M, Souza ND, Picotti P. Detecting Protein-Small Molecule Interactions Using Limited Proteolysis-Mass Spectrometry (LiP-MS) [J].Trends Biochem Sci,2020. 45(10):919-920.[2] Liu M, Xie WJ, Zhang X, et al. Sodium butyrate regulates macrophage polarization by TGR5/β-arrestin2 in vitro [J].Mol Med, 2025. 31(1):31.[3] Du X, Qi Z, Chen S, et al. Synthetic Retinoid Sulfarotene Selectively Inhibits Tumor-Repopulating Cells of Intrahepatic Cholangiocarcinoma via Disrupting Cytoskeleton by P-Selectin/PSGL1 N-Glycosylation Blockage [J].Adv Sci (Weinh),2025. 12(3): e2407519.[4] Zhang W, Wang M, Song Z, et al. Farrerol directly activates the deubiqutinase UCHL3 to promote DNA repair and reprogramming when mediated by somatic cell nuclear transfer [J].Nat Commun,2023. 14(1):1838.