背景介绍外泌体(exosomes)是一类由细胞分泌到胞外的囊泡最早由Pan和Johnstone在绵羊网织红细胞中发现并命名。随着研究的深入人们发现包括血细胞、免疫细胞、癌细胞、干细胞等在内的几乎所有细胞都可以产生外泌体所产生的外泌体不仅存在于细胞培养液中也存在于血液、尿液、母乳、唾液、胸腔积液等体液中。外泌体可携带供体细胞中的一些物质被认为是细胞间通讯和物质交换的重要载体可通过直接或间接的形式调控细胞的功能和生物学行为。研究表明外泌体参与肿瘤疾病的发展进程可作为肿瘤的无创液体活检中重要的标志物。外泌体的应用主要在疾病治疗、生物标志物、药物递送等三大领域。一、外泌体的提取与纯化如何高效、高纯度地富集外泌体是实现其组学分析和功能研究的关键。然而外泌体体积小密度低加之在粒径与组成方面存在异质性即使同种细胞产生的外泌体也有可能形态各异给外泌体的提取带来巨大困难。如今已发展了多种基于外泌体尺寸、密度及免疫表型的提取方法包括超速离心法、密度梯度离心法、聚合物沉淀法、超滤法、尺寸排阻色谱、免疫亲和法等[1]。图1 常用的外泌体分离方法1、超速离心法首先在300、2000和10000g离心力作用下去除样本中的细胞、细胞碎片和大囊泡随后在110000g条件下收集外泌体最后用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗沉淀以去除可溶的干扰蛋白质图1a2、密度梯度离心法属于一种更为严格的超速离心法能够根据样品密度进一步纯化囊泡克服蛋白质共沉淀造成的污染。常用的分离介质包括碘克沙醇和蔗糖。以蔗糖为例实际操作时需要预先制备不同浓度梯度的蔗糖/D2O溶液随后加入待分离物质。在超速离心力的作用下外泌体将在等密度区域(1.13~1.19g/mL) 驻留收集该组分即可得纯化的外泌体图1b3、尺寸排阻色谱法以不同粒径的聚合物凝胶填料作为分离介质基于尺寸特征实现外泌体的分离图1c。色谱柱采用稳定、多孔的凝胶颗粒填充将含有外泌体的溶液加入到色谱柱中时较小的颗粒将被捕获在孔中而较大的分子则不会进入孔中并被率先洗脱。因此不同阶段的洗脱部分将包含不同大小的分子首先是较大的外泌体颗粒其次是较小的蛋白质和脂质颗粒4、超滤法其原理与传统的膜分离法相同。该方法通常选用相对分子截留量为100kDa 的超滤管能够在提取外泌体的同时浓缩样本量尤其适用于细胞培养液、尿液等大体积样本图1d5、亲和法亲和提取法是目前特异性最好的一种外泌体提取方法也是唯一一种能够识别特定细胞来源的外泌体的方法。外泌体的亲和提取主要通过抗体与外泌体膜蛋白质之间的特异性相互作用实现图1e。所使用的抗体为单抗或多抗目标蛋白质可以是外泌体表面普遍具有的CD63、CD9、CD81等跨膜蛋白质、膜联蛋白质和上皮细胞黏附分子(EpCAM)等也可以是癌细胞外泌体表面独有的标志性蛋白质6、基于聚合物的共沉淀法聚合物沉淀法是商业化外泌体提取试剂盒通常采用的策略其中聚乙二醇是目前最常用的沉淀试剂。一般认为聚合物沉淀法的原理是聚合物通过“劫持”水分子降低外泌体溶解度进而在低速离心条件下发生沉降图1f。二、外泌体的表征手段目前可以通过电镜、动态光散射、纳米颗粒跟踪分析仪、蛋白质免疫印迹、酶联免疫吸附法、流式细胞仪等对外泌体进行表征。通过电镜可获得外泌体的形态信息不同类型的显微镜由于操作环境不同得到的外泌体形态存在差异。例如在扫描电镜、透射电镜和原子力显微镜中外泌体呈现囊泡独有的茶托形图2a可能由于样品在固定或染色过程中极度脱水导致外泌体塌陷所致。与之相反在冷冻电镜中外泌体呈现圆形由于不会脱水变性所得的外泌体形态可能更加接近囊泡的真实状态图2b。另外由于透射电镜和原子力显微镜具有较高分辨率也能够提供外泌体磷脂双分子层厚度、粒径分布等信息图2c。图2a 扫描电镜下外泌体呈现囊泡独有的茶托形[2]。图2b 冷冻电镜下外泌体呈现圆形形态可能更加接近囊泡的真实状态[3]。图2c 透射/原子力电镜下可观察到外泌体磷脂双分子层[4]。图2 用不同类型显微镜观察的外泌体形态虽然目前几种常用的表征方法尚有不足但是多种方法结合能够提高对外泌体的表征精度。随着各项技术的发展未来有望实现外泌体的准确、快速、可靠分析。三、外泌体的示踪技术对分离的外泌体进行体外标记或体内活体示踪有助于对外泌体的功能进行进一步的研究。目前对于外泌体的标记方法有很多种如荧光标记、生物素标记、量子点标记、免疫标记、同位素标记、基因标记等。其中荧光标记由于操作简单方便是科研人员最常用的外泌体标记方法。外泌体标记荧光染料包括DiR、DiI、DiO、DiD等其中DiR的近红外荧光可以穿透细胞和组织也常用于小动物体内示踪。此外标记细胞膜的PKH26和PKH67试剂盒也被用于外泌体的标记。下面小爱就以文献为例给大家详细介绍DiR标记外泌体并用于体内示踪的具体步骤[5]。1、准备好分离纯化的外泌体2、用2μM DiR在37℃下标记外泌体1h然后用SuperEV 0.5纯化柱纯化。3、将不同量的外泌体腹腔注射到小鼠体内。注射24h后将小鼠麻醉并使用NIR-II Imaging System H成像系统成像。为了进一步分析外泌体在组织中的位置对组织进行筛选、固定和切片并使用尼康TI2-EA1 R共聚焦显微镜检测DiR信号(Ex/Em 748/780nm)。图3 外泌体(EVs)治疗24h后大多数荧光信号仍留在正常小鼠的注射部位(a)。相反在EVs处理的AP小鼠中荧光信号扩散到腹部胰腺显示出比用F4/80- EVs治疗的AP小鼠更强的荧光信号。参考文献[1] 高方园,焦丰龙,张养军,等.外泌体分离技术及其临床应用研究进展[J].色谱, 2019, 37(10):13.[2] Shao H, Im H, Castro C M, et al. New Technologies for Analysis of Extracellular Vesicles[J]. Chemical Reviews, 2018, 118(4):1917.[3] Li P, Kaslan M, Lee S H, et al. Progress in Exosome Isolation Techniques[J]. Theranostics, 2017,7(3):789.[4] Pisitkun T, Shen R F, Knepper M A. Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2004, 101(36): 13368.[5] Gao Y, Mi N, Wu W, et al. Transfer of inflammatory mitochondria via extracellular vesicles from M1 macrophages induces ferroptosis of pancreatic beta cells in acute pancreatitis[J]. J Extracell Vesicles, 2024;13(2):e12410.