易基因｜疾病研究：DNA甲基化和转录组学特征在高浆卵巢癌复发和耐药过程中高度保守

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2022年07月27日，《J Exp Clin Cancer Res》杂志发表了题为“DNA methylation and transcriptomic features are preserved throughout disease recurrence and chemoresistance in high grade serous ovarian cancers”的研究论文，该研究通过全基因组DNA甲基化测序（WGBS）和对应的转录组测序（RNA-seq）分析联合揭示DNA甲基化和基因表达在原发性高级别浆液性卵巢癌（high grade serous ovarian cancer, HGSOC,高浆）的疾病进展过程中是保守的。

标题：DNA methylation and transcriptomic features are preserved throughout disease recurrence and chemoresistance in high grade serous ovarian cancers（DNA甲基化和转录组学特征在高级别浆液性卵巢癌的整个疾病复发和耐药过程中是保守的）

时间：2022.07.27

期刊：Journal of Experimental & Clinical Cancer Research

影响因子：IF 12.658/1区

技术平台：WGBS、RNA-seq

样本实验：

对28例III/IV期HGSOC女性患者的62个新鲜冷冻匹配的原发性和复发性肿瘤组织样本进行全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）和转录组测序（RNA-seq），其中11例患者携带BRCA1和/或BRCA2突变。

摘要：

背景

目前对全基因组DNA甲基化在高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）复发和化疗耐药中的作用知之甚少。

方法

对28例III/IV期HGSOC患者的62个原发性和复发性肿瘤组织样本进行了WGBS+RNA-seq测序分析。

结果

原发性和复发性肿瘤的全基因组甲基化（平均每个肿瘤24.2M CpG）和转录组特征在不同患者之间表现出广泛的异质性，但在同一患者的肿瘤中高度保守。研究结果发现，与BRCA1/2不突变肿瘤相比，BRCA1/2突变肿瘤中的差异甲基化区域（DMR）存在显著差异（对照分析比较中分别为659个DMR和388个DMR）。表明BRCA1/2携带者的免疫通路过表达，提示免疫应答增强有助于提高生存率（P=0.006）。

结论

本研究表明，即使经过化疗后，原发性肿瘤中的DNA甲基化和基因表达水平在整个疾病进展过程中是保守的，且DNA甲基化和基因表达的变化不太可能成为HGSOC化疗耐药的驱动因素。

结果图形

（1）匹配的原发性和复发性高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）的全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）和转录组对照分析

图1：复发性高级别浆液性卵巢癌患者的临床特征

1. 有和无BRCA1/2突变的女性原发性和复发性肿瘤位置；
2. 每位患者的病程。实心圆表示在本研究中描绘的肿瘤，空心圆表示收集但未描绘的肿瘤；
3. 与非BRCA1/2突变肿瘤相比，携带BRCA1/2突变肿瘤的女性患者生存率提高；
4. 用于分析的样品选择和QC过程。

（2）部分甲基化区域（PMD）的高变异性导致患者之间的肿瘤异质性

图2：高级别浆液性卵巢癌的全基因组甲基化异质模式

1. 原发性和复发性肿瘤表现出全基因组甲基化的异质模式，许多肿瘤在X染色体上表现出低甲基化（CpG值平均在10kB范围内，去除ENCODE'黑名单'区域）；
2. 染色体1q42.13和22q13.33两个区域示例，显示两个比较中的差异甲基化区域（方框区域）：原发性和复发性肿瘤（左）、BRCA1/2突变携带者与BRCA1/2突变非携带者（右）。

图3：高级别浆液性卵巢癌中部分甲基化区域（PMD）内的高甲基化由soloWCGW驱动

1. PMD-masking strategy说明。鉴定PMD后，在后续分析中mask这些基因组区域；
2. 队列中检测到的大多数PMD为单肿瘤独有，只有2%的PMD在30多个肿瘤中同时观察到；
3. 主成分（PCA）分析表明，肿瘤之间的大部分差异由PMD-soloWCGW位点甲基化导致。Mask基因组中常见的PMD和OVCAPMD可消除差异；
4. 所有可能的肿瘤对的成对比较分析。Mask PMD后，PMD-soloWCGW差异与成对欧几里德距离之间的强相关性消失

图4：如部分甲基化区域（PMD）内的基因表达所示，所有患者原发性和复发性肿瘤的甲基化和转录水平基本保守

1. 与PMD外的基因相比，多个肿瘤标本共有PMD内的基因低表达（左），但表达变化较大（右）；
2. 癌症中的绝大多数肿瘤抑制基因和形成（《癌症基因组图谱》定义的卵巢癌分子亚型的基因位于PMD外）；
3. 匹配对照的RNA-seq显示甲基化（上）和基因表达（下）中患者内成对欧几里得距离显著小于患者间距离或阶段内距离。

（3）低甲基化增加免疫相关基因表达，并鉴定BRCA1/2突变HGSOC疾病复发的潜在驱动因素

图5：BRCA1/2突变肿瘤甲基化和表达水平的显著差异

1. BRCA1/2突变肿瘤中鉴定出135个差异甲基化区域（DMR），而BRCA1/2非携带者肿瘤中有高甲基化趋势；BRCA1/2非携带者肿瘤中有101个区域高甲基化，而BRCA1/2突变肿瘤中只有34个区域高甲基化；
2. PMD mask后的全基因组CpG甲基化水平的主成分分析显示BRCA1/2突变状态的肿瘤差异趋势；
3. 基因表达数据的主成分分析显示BRCA1/2突变状态的肿瘤聚类趋势；
4. 比较BRCA1/2突变与不突变肿瘤差异表达基因火山图。橙色表示BRCA1/2基因突变肿瘤中显著上调基因（Padj<0.05），紫色表示显著下调的基因；
5. BRCA1/2突变与不突变肿瘤的上调（橙色）和下调（紫色）差异表达基因的KEGG基因集富集分析；
6. BRCA1/2不突变肿瘤高甲基化区域的甲基化水平与基因表达相关的单个基因NAGLU、CDK2AP1、FGF18（P<0.005)。

结论：

本研究通过全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）对原发性和化疗后耐药复发的HGSOC进行全面的DNA甲基化水平综合分析，并对有无BRCA1/BRCA2突变的肿瘤进行首次此类比较。与单细胞分析一致，本研究发现不同HGSOC患者之间存在分子异质性，并为这种异质性扩展到化疗耐药、复发性疾病提供了证据。它们没有共同的甲基化特征或特定的甲基化生物标志物，表明与疾病复发或化疗耐药相关的共同机制和潜在生物学，并通过转录组分析在相同的原发性复发组织标本中对该结果进行重复验证。数据表明在一线化疗后耐药和复发性肿瘤中的甲基化和转录组学变化可能已经存在于原发性肿瘤中，并不由化疗而诱导。在比较有或无BRCA1/BRCA2突变的原发性肿瘤时，观察到显著的甲基化和/或转录组学特征变化。BRCA1或BRCA2突变患者的生存期和无疾病进展生存期的改善归因于对铂类化学药物治疗的反应改善，本研究发现比较组之间的甲基化和转录组差异可能导致这些差异。

关于易基因全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）技术

全基因组重亚硫酸盐甲基化测序（WGBS）可以在全基因组范围内精确的检测所有单个胞嘧啶碱基（C碱基）的甲基化水平，是DNA甲基化研究的金标准。WGBS能为基因组DNA甲基化时空特异性修饰的研究提供重要技术支持，能广泛应用在个体发育、衰老和疾病等生命过程的机制研究中，也是各物种甲基化图谱研究的首选方法。

易基因提供的全基因组甲基化测序技术通过T4-DNA连接酶，在超声波打断基因组DNA片段的两端连接接头序列，连接产物通过重亚硫酸盐处理将未甲基化修饰的胞嘧啶C转变为尿嘧啶U，进而通过接头序列介导的 PCR 技术将尿嘧啶U转变为胸腺嘧啶T。

应用方向：

WGBS广泛用于各种物种，要求全基因组扫描（不错过关键位点）

• 全基因组甲基化图谱课题
• 标志物筛选课题
• 小规模研究课题

技术优势：

• 应用范围广：适用于所有参考基因组已知物种的甲基化研究；
• 全基因组覆盖：最大限度地获取完整的全基因组甲基化信息，精确绘制甲基化图谱；
• 单碱基分辨率：可精确分析每一个C碱基的甲基化状态。

易基因科技提供全面的DNA甲基化研究整体解决方案，技术详情了解请致电易基因。

参考文献：

Gull N, Jones MR, Peng PC, Coetzee SG, Silva TC, Plummer JT, Reyes ALP, Davis BD, Chen SS, Lawrenson K, Lester J, Walsh C, Rimel BJ, Li AJ, Cass I, Berg Y, Govindavari JB, Rutgers JKL, Berman BP, Karlan BY, Gayther SA. DNA methylation and transcriptomic features are preserved throughout disease recurrence and chemoresistance in high grade serous ovarian cancers. J Exp Clin Cancer Res. 2022 Jul 27;41(1):232.

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